EBV潛伏膜蛋白2的結(jié)構與功能分析

鄭美霞，劉建曉，鞏文詞，朱珊麗，李文姝，張麗芳

(溫州醫(yī)學院 微生物學與免疫學教研室，浙江 溫州 325000)

EBV潛伏膜蛋白2的結(jié)構與功能分析

鄭美霞，劉建曉，鞏文詞，朱珊麗，李文姝，張麗芳

(溫州醫(yī)學院 微生物學與免疫學教研室，浙江 溫州 325000)

目的：預測和分析EBV潛伏膜蛋白2（LMP2）的結(jié)構和功能。方法：采用互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫和生物軟件，從SwissProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中檢索LMP2的氨基酸序列，通過生物軟件分析預測其理化性質(zhì)、二級結(jié)構及空間結(jié)構。結(jié)果：分析顯示LMP2由497個氨基酸組成，分子量53011.4 Da，等電點4.85，為疏水性蛋白；具有12個疏水跨膜區(qū)，其N端含有免疫受體酪氨酸活化基序（ITAM）和脯氨酸富集基序（PY基序），前者位于氨基酸序列 74～77和85～88處，后者位于56～60和 97～101處；含有15個α螺旋結(jié)構和7個β片層結(jié)構，通過無規(guī)則卷曲連接α螺旋和β片層。結(jié)論：通過對LMP2生物信息學的分析，獲得了此蛋白的理化特性及部分參與調(diào)節(jié)跨膜信號傳導功能區(qū)的信息，為進一步研究EBV的感染與致病機制、研制EBV亞單位疫苗等奠定基礎。

皰疹病毒4型，人；潛伏膜蛋白；蛋白質(zhì)結(jié)構，二級；生物信息學

EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）是人類γ皰疹病毒，呈全球分布，感染率高，是傳染性單核細胞增多癥的病原體，并與鼻咽癌、口腔腺體腫瘤、淋巴瘤、何杰金氏病、胃癌以及器官移植后的B細胞淋巴瘤、艾滋病相關的淋巴瘤等密切相關[1]。研究證實，在所有病理類型的鼻咽癌組織中均發(fā)現(xiàn)了EBV的DNA，在異型增生組織和原位癌中也存在。EBV在潛伏感染時，表達潛伏膜抗原（the latency membrane protein，LMP）LMP1和LMP2。研究表明LMP1為腫瘤源性蛋白，而LMP2則不具細胞轉(zhuǎn)化作用，因此，LMP2是研究抗EBV感染疫苗的理想靶抗原。本研究利用計算機輔助生物學軟件和網(wǎng)絡相關數(shù)據(jù)庫對LMP2進行結(jié)構預測和功能分析，進一步了解EBV潛伏感染的機制，并對EBV感染相關腫瘤的治療和疫苗的設計研究提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料 利用在線生物信息學軟件：SwissProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，Expasy服務器及LOMETS在線預測軟件[2-3]（http://www.uniprot.org/，http://expasy. org/，http://zhang.bioinformatics.ku.edu/ LOMETS/）對EBV LMP2進行結(jié)構預測和功能分析。1.2方法 EBV LMP2的氨基酸序列檢索于瑞士生物信息研究所提供的SwissProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，使用Expasy（http://expasy.org/）服務器中的ProtParam（http://expasy.org/tools/protparam. html）預測LMP2的理化性質(zhì)，GOR（http://expasy. org/tools/）和ProdectProtein（http://www. predictprotein.org/）分析LMP2的二級結(jié)構，TopPred（http://expasy.org/tools/）預測其拓撲結(jié)構模式，其空間結(jié)構是通過LOMETS（http:// zhang.bioinformatics.ku.edu/LOMETS/）在線軟件進行預測。

2 結(jié)果

2.1 EBV LMP2理化性質(zhì)ProtParam結(jié)果顯示LMP2含有497個氨基酸，分子量為53011.4Da，等電點4.85，分子式為C2434H3835N591O671S28；LMP2不穩(wěn)定系數(shù)II值（instability index，II）為47.27，表明此蛋白性質(zhì)不穩(wěn)定，其疏水性GRAVY（grand average of hydropathicity）值為0.719，表明其親水性較差，為疏水性蛋白。

2.2 EBV LMP2的二級結(jié)構應用ProdectProtein和Expasy服務器上的GOR預測LMP2的二級結(jié)構。GOR預測顯示其二級結(jié)構由α螺旋Alpha helix (Hh)：37.83%、β-片層Extended strand（Ee）:18.71%、無規(guī)則卷曲Random coil（Cc）:43.46%構成。其二維結(jié)構顯示LMP2蛋白具有12個螺旋跨膜區(qū)，其N端和C端均在胞漿內(nèi)，見圖1。EBV LMP2功能區(qū)免疫受體酪氨酸活化基序ITAM（YXXL）和PY基序均在N端，前者分別位于氨基酸序列74～77和85～88處，后者分別位于56～60和97～101處，均位于胞漿內(nèi)，其具體氨基酸序列分別為YQPL、YLGL和PPPPY。

圖1 EBV LMP2潛伏膜蛋白拓撲結(jié)構圖

2.3 EBV LMP2空間結(jié)構利用在線軟件LOMETS對LMP2的空間結(jié)構進行預測，通過分值、可信度及氨基酸數(shù)等參數(shù)的綜合分析，篩選出各參數(shù)值均高的模板，將其導入Rasmol和Vector NTI軟件中，分析推測其三級結(jié)構，結(jié)果顯示LMP2結(jié)構主要包含15個α螺旋結(jié)構、7個β片層結(jié)構，其中有12個α螺旋構成跨膜區(qū)，通過無規(guī)則卷曲連接α螺旋和β片層，與二級結(jié)構預測的結(jié)果相符；其ITAM和PY基序位于N端的無規(guī)則卷曲內(nèi)，見圖2。

圖2 EBV LMP2空間結(jié)構

3 討論

EBV主要通過其包膜糖蛋白gp350/220結(jié)合B細胞上的受體即CD21分子感染B淋巴細胞或上皮細胞。通常在初次感染后，潛伏于宿主細胞內(nèi)而形成長期攜帶狀態(tài)，但在某些因素的影響下，EBV的潛伏感染可使細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，因此EBV感染與多種腫瘤的發(fā)生密切相關。

EBV的基因組為線性雙鏈DNA分子，大小約為173 kb。在其感染的細胞中可檢測到病毒基因組編碼的6種EBV核抗原（EBNAs1、2、3A、3B、3C、LP）和3種潛伏膜蛋白（LMPs1、2A和2B）等產(chǎn)物。其中，LMP2有LMP2A和LMP2B兩種類型，分別由497個氨基酸和378個氨基酸組成。前者編碼基因僅比后者多了一個外顯子，即LMP2A的第一個外顯子編碼親水性N末端的119個氨基酸[4]。生物信息學分析獲知LMP2A屬于一種磷酸化膜蛋白，含有ITAM和PY基序功能區(qū)，均位于胞漿內(nèi)。通過對LMP2A的三維結(jié)構預測得知其功能區(qū)位于不規(guī)則卷曲內(nèi)，柔韌性好，有利于招募信號蛋白或激酶及相互結(jié)合及作用，引發(fā)下游事件，對感染細胞的信號轉(zhuǎn)導進行正向或負向的雙向調(diào)節(jié)，從而維持EBV的潛伏感染。

LMP2對信號轉(zhuǎn)導的正向調(diào)節(jié)作用表現(xiàn)為，EBV LMP2參與ITAM的構成，LMP2A的N端參與了ITAM的構成，即LMP2A74～77的和LMP2A85～88氨基酸，序列分別為YQPL和YLGL，其中LMP2A中的74位和85位酪氨酸是形成具有ITAM功能的特征性序列（YXXL）關鍵的氨基酸殘基，能與含有SH2結(jié)構域的Syk、Lyn、Fyn酪氨酸激酶結(jié)合。因此，YQPL和YLGL是具有非常重要功能的氨基酸序列[5]。研究表明，單拷貝ITAM特征性序列[YXXL]2表達即可激活B細胞或T細胞信號傳導途徑，進而觸發(fā)細胞內(nèi)信號傳導[3]。但Richard等[6]認為LMP2A本身很可能并不是酪氨酸激酶，只是與胞內(nèi)酪氨酸激酶相關，在EBV感染的B淋巴細胞或表達LMP2的B淋巴細胞中，LMP2是B淋巴細胞酪氨酸激酶的重要底物。就像多瘤病毒的轉(zhuǎn)化蛋白MT抗原，本身沒有內(nèi)在的生化活性，但是此抗原與酪氨酸激酶Src家族成員如Lyn、Fyn等相關，從而導致各激酶活化。

LMP2對信號轉(zhuǎn)導的負向調(diào)節(jié)表現(xiàn)在：①EBV LMP2可通過模擬B細胞抗原受體（BCR）而對信號轉(zhuǎn)導的負向調(diào)節(jié)作用。EBV LMP2中的YXXL序列與BCR中Igα和Igβ的部分序列具有同源性，因此，EBV LMP2模擬BCR，通過Ras/PI3-K/Akt途徑激活下游的Ras/MEK/ERK等激酶，改變核因子如NF-κB的表達來調(diào)節(jié)B細胞的增殖和存活，以達到EBV的持續(xù)潛伏感染的目的；或可通過阻止B細胞膜表面免疫球蛋白交聯(lián)，抑制BCR與胞內(nèi)蛋白酪氨酸激酶的結(jié)合，從而維持B細胞內(nèi)EBV的潛伏感染；或可通過LMP2A模擬激活B細胞受體，干擾在B淋巴細胞發(fā)育過程轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[7]。Cheryl等[8]報道LMP2A的N末端胞漿區(qū)域可與B淋巴細胞Src家族酪氨酸激酶如Lyn和Fyn等通過YXXL序列相互作用，從而阻止酪氨酸磷酸化和鈣動員來影響細胞BCR免疫球蛋白的交聯(lián)，從而抑制正常BCR跨膜信號的傳導，以此來維持EB病毒的潛伏感染。②EBV LMP2可通過脯氨酸富集基序（PY基序）對細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導起負向調(diào)節(jié)作用。LMP2A氨基酸N端含有兩個保守的PY基序（PPPPY），分別位于LMP2A56～60和LMP2A97～101處。Nedd4泛素化蛋白連接酶中含有WW功能區(qū)，能夠通過識別PY基序，導致LMP2A和Lyn PTK很快降解，從而下調(diào)B細胞信號傳導，維持EBV在B細胞內(nèi)的潛伏感染[9-10]。

蛋白質(zhì)的生物學功能在很大程度上取決于其空間結(jié)構，蛋白質(zhì)結(jié)構構象多樣性導致了其具有多種生物學功能。蛋白的結(jié)構與功能關系研究是進行蛋白功能預測及蛋白質(zhì)設計的基礎，蛋白分子只有處于特定的三維空間結(jié)構情況下，才能獲得特定的生物活性；而三維空間結(jié)構稍有破壞，就很有可能會導致蛋白質(zhì)生物活性的降低甚至喪失。因此，利用生物信息學軟件對LMP2的空間結(jié)構進行預測分析將有助于確認此蛋白的功能單位或者結(jié)構域，可為設計新的蛋白質(zhì)或改造已有蛋白質(zhì)提供可靠的依據(jù)，同時為新的藥物分子設計提供合理的靶分子及結(jié)構。

通過對EBV LMP2的結(jié)構功能分析表明EBV LMP2的N端包含ITAM和PY重要的功能基序，對維持EB病毒的潛伏持續(xù)感染起至關重要作用。對LMP2A結(jié)構和功能的分析，有助于為EBV潛伏感染、致瘤機制和亞單位疫苗設計提供依據(jù)。

[1] 鄧路瑤,肖雨萌,黃鶴,等.Epstein-Barr 病毒與其相關疾病研究進展[J].美中醫(yī)學,2007,4(6):41-44.

[2] 歐琴,朱珊麗,張麗芳.EB病毒潛伏膜蛋白2的二級結(jié)構分析和B細胞表位預測[J]. 溫州醫(yī)學院學報, 2007, 37(2):114-118.

[3] Wu S, Zhang Y. LOMETS: a local meta-threading-server for protein structure prediction[J]. Nucleic Acids Res,2007, 35(10):3375-3382.

[4]朱偉,羅兵.EBV潛伏膜蛋白LMP2A的研究進展[J].國際病毒學雜志,2007,14(4):120-123.

[5] Lu J, Lin WH, Chen SY, et a1. Syk tyrosine kinase mediates Epstein-Barr virus latent membrane protein 2A-induced cell migration in epithelial cells [J].J Biol Chem,2006,281(3): 8806-8814.

[6] Anderson LJ, Longnecker R. EBV LMP2A provides a surrogate pre-B cell receptor signal through constitutive activation of the ERK/MAPK pathway[J]. J Gen Virol,2008,89 (7):1563-1568.

[7] Fukuda M,Longnecker R. Epstein-Barr virus (EBV) latent mmembrane protein 2A regulates B-cell receptor-induced apoptosis and EBV reactivation through tyrosine phosphorylation[J]. J Virol,2005,79(13):8655-8660.

[8] Miller CL, Lee JH, Kieff E, et a1.An integral membrane protein (LMP2) blocks reactivation of Epstein-Barr virus from latency following surface immunoglobulin crosslinking [J]. Proc Natl Acad Sci USA ,1994,91(2):772-776.

[9] Seo MD, Park SJ, Kim HJ, et a1. Identification of the WW domain-interaction sites in the unstructured N-terminal domain of EBV LMP 2A[J]. FEBS Lett,2007,581(1):65-70.

[10] Morrison JA, Raab-Traub N. Roles of the ITAM and PY motifs of Epstein-Barr virus latent membrane protein 2A in the inhibition of epithelial cell differentiation and activation of β-catenin signaling [J]. J Virol,2005,79(4): 2375-2382.

（本文編輯：胡苗苗）

Analysis of the structure and function for the latent membrane protein 2 of EBV

ZHENG Meixia，LIU Jianxiao，GONG Wenci，ZHU Shanli，LI Wenshu，ZHANG Lifang.

Deptartment of Microbiology & Immunology，Wenzhou Medical College，Wenzhou，325000

Objective: To predict and analyze the structural and functional characteristics of the latent membrane protein 2 (LMP2) of Epstein-Barr virus (EBV). Methods: From SwissProt the amino acid sequences of LMP2 were obtained. Physio-chemical property， the secondary structure and tertiary structure of LMP2 were analyzed by the computational analysis and bioinformatics webs，Expasy and LOMETS，respectively. Results:The results showed that LMP2 is made up of 497 amino acids with molecular weight 53011.4Da and PI 4.85. It is an acidic protein which owns 12-transmembrane domains and contains immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) and PY motif. The ITAM is located at the positions of amino acid sequence 74～77 and 85～88 and the PY motif is located at 56～60 and 97～101. LMP2 contains 15 α-helices and 7 β-sheet which are connected by random coils. Conclusion: Through bioinformatics analysis，the characteristics and some signaling information of LMP2 were obtained，which would be the basis for further study of its infection， pathogenesis， and new subunit vaccines.

Herpesvirus 4，human；latent membrane protein；protein structure，secondary；bioinformatics

R373.9

A

1000-2138 (2010)03-0218-03

2009-11-10

國家自然科學基金資助項目（30671882）。

鄭美霞（1983-），女，浙江衢州人，碩士生。

張麗芳，教授，碩士生導師，Email：wenzhouzlf@ 126.com。