7種不同蜜源蜂蜜的化學(xué)組成及抗氧化性

郭夏麗,羅麗萍＊,冷婷婷,付 婷,丁紅秀

1南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院,南昌 330031;2江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,南昌 330022

7種不同蜜源蜂蜜的化學(xué)組成及抗氧化性

郭夏麗1,羅麗萍1＊,冷婷婷1,付 婷1,丁紅秀2

1南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院,南昌 330031;2江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,南昌 330022

為了解不同蜜源蜂蜜的化學(xué)組成及抗氧化活性差異,并探索二者關(guān)系,本文較系統(tǒng)的研究了7種不同蜜源蜂蜜的化學(xué)組成及抗氧化性,為評(píng)價(jià)蜂蜜的保健功能提供了理論依據(jù)。實(shí)驗(yàn)采用分光光度法測定了蜂蜜色度、總酚和總黃酮含量;以 23種酚類化合物為對(duì)照品,利用高效液相色譜法 (High-performance liquid chromatography,HPLC)測定了蜂蜜中的酚類化合物;最后測定了蜂蜜的抗氧化能力。對(duì)上述指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析表明,色度值越大,蜂蜜中的總酚和總黃酮含量越高;蜂蜜的總酚含量與其抗氧化活性相關(guān)性極顯著(R2=0.881＊＊);整體上表現(xiàn)出蜂蜜顏色越深,總酚與總黃酮含量越高,其抗氧化能力越強(qiáng)。

蜂蜜;總酚;總黃酮;總抗氧化能力;自由基清除活性

蜂蜜為蜜蜂科昆蟲中華蜜蜂 (A ips ceranaFebricius)或意大利蜂 (A ips m elliferaLinnaens)采集植物花蜜或分泌物,經(jīng)過充分釀造而貯藏在巢脾內(nèi)的甜物質(zhì)。其中,總糖量占 75%以上,水分 16%～25%,蛋白質(zhì)平均含量 0.16%,此外還含有少量的揮發(fā)油、有機(jī)酸、花粉及多種酶類和微量元素。蜂蜜在世界范圍內(nèi)被廣泛應(yīng)用,是藥品生產(chǎn)中很好的甜味劑、粘合劑、抗氧劑等[1]。藥理實(shí)驗(yàn)證明,蜂蜜有潤腸、護(hù)肝、抗菌、抗炎[2]、抗癌[3]等作用。因此,蜂蜜又被稱為“天然抗生素”。

近年來,人們越來越關(guān)注具有藥物治療作用的抗氧化劑,天然食物中常常含有能清除自由基的天然抗氧化劑。與飲食有關(guān)的小分子抗氧化劑,如Vc、Ve和類蘿卜素對(duì)抗衰老具有良好作用。然而,一些研究表明,酚類物質(zhì),如類黃酮和酚酸具有更強(qiáng)的抗氧化能力。蜂蜜中含有一些抗氧化劑,包括Vc、Ve、酶 (過氧化氫酶等)及一些酚類物質(zhì)[4]。

國外對(duì)蜂蜜的化學(xué)組成研究報(bào)道較多,如總酚和總黃酮含量的測定,以及其抗氧化性的測定,而國內(nèi)相對(duì)來說較少。本文選擇了中國所產(chǎn)的 7種較為常見的蜜源蜂蜜為實(shí)驗(yàn)材料,對(duì)其色度、總酚、總黃酮含量和抗氧化活性進(jìn)行了測定,并分析了各指標(biāo)之間的相關(guān)性,旨在為中國蜂蜜的品質(zhì)評(píng)價(jià)和消費(fèi)者選購蜂蜜提供一些參考意見。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

市場上蜂蜜品種繁多,多以蜜源分類和定價(jià)。已有研究表明,蜂蜜顏色與其總酚含量和抗氧化能力有一定關(guān)系[5、6]。據(jù)此,經(jīng)過市場調(diào)查后,選取了7種市場占用率較高、且從外觀上觀察具有顏色梯度的蜂蜜為實(shí)驗(yàn)材料。具體種類如下 (按照顏色由淺至深排列):洋槐蜜、紫云英蜜、黨參蜜、土黃連蜜、龍眼蜜、棗花蜜,均由江西汪氏蜜蜂園有限公司提供;野桂花蜜由遂川大洲天然食品開發(fā)基地提供。7種蜂蜜表觀特征見表 1。

1.2 化學(xué)試劑

DPPH·:Sigma-aldrich公司;肉桂酸、槲皮素、柚皮素、染料木素、山奈酚、芹菜素、p-香豆酸、阿魏酸為中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心產(chǎn)品;沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、咖啡素、木犀草素、異鼠李素為中國藥品生物制品檢定所產(chǎn)品;楊梅酮、菲瑟酮、生松素為 Sigma-aldrich公司產(chǎn)品;桑黃素、黃芩素、α-兒茶素為君創(chuàng)生物科技有限公司產(chǎn)品;3, 4-二甲氧基肉桂酸、白楊素為上海精純試劑有限公司產(chǎn)品;蘆丁為中國醫(yī)藥 (集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品;甲醇為色譜純;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)器材

JA1003N電子天平:精密科學(xué)儀器有限公司,上海;GZX-DH-50-55-s電熱恒溫干燥箱:躍進(jìn)醫(yī)療器械廠,上海;HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋:國華電器有限公司,江蘇;7200可見分光光度計(jì):尤尼柯儀器有限公司,上海;SHB-II IA型循環(huán)水式多用真空泵:河南太康教材儀器廠;KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器:昆山市超聲儀器公司,江蘇。

美國 Agilent 1200型高效液相色譜儀,包括在線脫氣裝置,四元泵,柱溫箱,光電二級(jí)管陣列檢測器 (DAD),手動(dòng)進(jìn)樣裝置,及 G2170BA LC化學(xué)工作站;50μL微量進(jìn)樣器。

1.4 蜂蜜色度的測定

將蜂蜜用蒸餾水溶解,配制成體積比 50%的工作液,在 450 nm下測定其吸光值。色度值以吸光度值計(jì)[8]。

1.5 蜂蜜中總酚含量的測定

準(zhǔn)確吸取 1 mL稀釋后的蜂蜜水溶液 (200 mg/ mL),加入 1 mL的 Folin-Ciocalteu試劑,混勻,然后加入 5 mL 1 mol/mL的Na2CO3溶液,用蒸餾水將混合液定容至 10 mL,混合均勻,在室溫、避光條件下放置 1 h,于 760 nm處測定其吸光度值。試驗(yàn)數(shù)據(jù)平行測定 3次,結(jié)果用±sD表示。將對(duì)照品沒食子酸配置成 0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照上述方法制定標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中的總酚含量,蜂蜜總酚含量以沒食子酸的相對(duì)量(mg GAC/ g honey)表示[7]。

1.6 蜂蜜中總黃酮含量的測定

準(zhǔn)確吸取 2 mL 3 g/mL的蜂蜜水溶液于 20 mL容量瓶中,各瓶中分別加入 0.6 mL 15 g/100 mL的NaNO3溶液,再加入 0.6 mL 10 g/100 mL的 AlCl3溶液,8 mL 4 g/100 mL的 NaOH溶液,混勻后用蒸餾水定容至刻度。室溫靜置 15 min后,于 415 nm波長處測定吸光度值。將對(duì)照品槲皮素配置成 0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照上述方法制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。蜂蜜總黃酮含量以槲皮素的相對(duì)量表示[8]。

1.7 蜂蜜醇提物的HPLC分析

1.7.1 實(shí)驗(yàn)材料制備

蜂蜜中含有大量糖類大分子,采用 HPLC方法時(shí),需將蜂蜜進(jìn)行預(yù)處理,以免大分子堵塞高效液相色譜儀而造成損壞。具體步驟如下:取 100 g蜂蜜樣品溶于 500 mL蒸餾水,用 HCl溶液調(diào)節(jié)至 pH 2.0,在室溫下用磁力攪拌器攪拌均勻,然后通過過濾棉除去溶液中的固體顆粒。過濾后的溶液與 150 g Amberlite XAD-2(孔徑為 9 nm,顆粒大小 0.3～1.2 mm)混合,用磁力攪拌器攪拌 10 min。將 Amberlite顆粒裝在玻璃柱 (42×3.2)中,然后用酸水(250 mL,pH 2.0 HCl)沖洗柱子,隨后用蒸餾水漂洗柱子以去除全部糖類物質(zhì)及其它組分。酚類物質(zhì)保留在柱中,用 400 mL甲醇將酚類物質(zhì)洗出。甲醇提取物在 40℃條件下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干,殘留物溶解于 5 mL蒸餾水,用乙醚(5 mL×3)提取。醚提取物混合后,在氮?dú)鈼l件下去除乙醚。干渣用甲醇復(fù)溶,配制成 10 mg/mL的蜂蜜醇提物。0.45μm濾膜過濾后進(jìn)樣[9]。

1.7.2 色譜條件

色譜柱:ZORBAX Eclipse XDB C18色譜柱 (4.6 mm×150 mm×5μm);流動(dòng)相:甲醇 (流動(dòng)相A)和0.1%甲酸-水溶液(流動(dòng)相B);梯度洗脫,其時(shí)間程序?yàn)?0 min→10 min→20min→30 min→60 min→70 min→75 min→80 min;甲醇含量 0%→15%→17%→32%→42%→50%→65%→25%,流速:1.0 mL/ min;DAD檢測波長:256 nm,280 nm;進(jìn)樣量 20 μL;柱溫:35℃。

1.7.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取各對(duì)照品 5 mg,置于 5 mL容量瓶中,加入甲醇溶解,用甲醇稀釋至刻度,終濃度為 1 mg/ mL,經(jīng) 0.45μm濾膜過濾后置于 4℃冰箱中避光保存,作為儲(chǔ)備液備用,其他濃度對(duì)照品由儲(chǔ)備液稀釋得到。

1.8 蜂蜜總抗氧化性的測定

采用普魯士蘭法。準(zhǔn)確吸取 1 mL各濃度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/mL)樣液,加入 2.5 mL PBS緩沖液(0.2 M,pH 6.6),再加入 2.5 mL鐵氰化鉀溶液;50℃水浴20 min后,加入 2.5 mL三氯乙酸搖勻,取 7.5 mL樣液,加入同體積雙蒸水,再加入 1.5 mL FeCl3溶液。搖勻,靜置 10 min,于 700 nm測定吸光值,以蘆丁作陽性對(duì)照。蜂蜜總抗氧化能力以蜂蜜濃度-吸光值線性回歸方程斜率 (K)表示[10]。

1.9 蜂蜜對(duì)DPPH·自由基的清除作用

將蜂蜜溶液用蒸餾水稀釋成 0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、8.0 g/mL。分別取各濃度樣液 0.1 mL,加入 3.9 mL 3～8 ug/mL DPPH·甲醇溶液 (現(xiàn)配現(xiàn)用),以 0.1 mL甲醇作空白。室溫黑暗條件下靜置 90 min后,于 517 nm測定其吸光值。

自由基清除率I%=(A0-AS)/A0×100%

A0——空白樣品的吸光度值

AS——不同濃度的被測混合物的吸光度值

IC50(50%抑制濃度)可通過自由基清除活性 -樣品濃度的線性關(guān)系求出[11]。

2 結(jié)果與討論

2.1 7種蜂蜜的色度值、總酚和總黃酮含量

7種蜂蜜的色度值、總酚和總黃酮含量見表 1。由表 1可知,7種蜂蜜色度值及化學(xué)組成都有很大差異。其中,色度值最大為 1.028(龍眼蜜),最小為 0.329(洋槐蜜)。蜂蜜總酚含量最高為 28.222 ±0.117 mg/g(棗花蜜),最低為 11.578±0.257 mg/g(洋槐蜜),總酚含量除黨參蜜和土黃連蜜差異顯著外,其余蜂蜜之間均達(dá)差異極顯著水平。蜂蜜總黃酮含量最高為 5.817±0.117 mg/g(棗花蜜),最低為 1.344±0.201 mg/g(野桂花蜜),除紫云英蜜與黨參蜜總黃酮含量差異不顯著外,其他蜂蜜差異均達(dá)極顯著水平。7種蜂蜜中,除野桂花蜜外,表觀顏色越深的蜂蜜,其色度值也越大。

表 1 7種蜂蜜表觀特征、色度值、總酚和總黃酮含量Table 1 Apparent characteristics,color intensity,total phenol,total flavonoids of seven honeys

對(duì) 7種蜂蜜的總酚和總黃酮含量與色度進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果見表 2。由表 2可知,7種蜂蜜的色度與總酚和總黃酮含量之間的相關(guān)性極顯著,色度值值越大,總酚和總黃酮含量越高。這與 Jasna研究結(jié)果類似[5],Jasna等人對(duì)斯洛文尼亞地區(qū)蜂蜜色度及其總酚含量進(jìn)行測定,并測得顏色較深的蜂蜜類型中總酚含量高,如冷杉蜜、云杉蜜、森林蜜,總酚含量分別為 241.4±39.5 mg/kg,217.5±20.6 mg/ kg,233.9±21.7 mg/kg。與顏色較淺的蜂蜜相比,顏色較深的蜂蜜總酚和總黃酮含量均比較高。說明不同顏色的蜂蜜在化學(xué)組成上存在差異。

2.2 7種蜂蜜的 HPLC分析結(jié)果

將對(duì)照品溶液制成 0.02 mg/mL單標(biāo)工作液,分別在 200～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,得到各對(duì)照品的紫外吸收峰。所掃描的 23種對(duì)照品中,吸收峰相對(duì)集中在 250,256,280,311,360 nm 5個(gè)波長。分別在上述 5個(gè)波長,對(duì)混合對(duì)照品進(jìn)行檢測。混合對(duì)照品在 256 nm和 280 nm兩個(gè)檢測波長下的出峰數(shù)及分離效果較好,故以這兩個(gè)波長作為檢測波長。對(duì) 7種蜂蜜色譜圖進(jìn)行相似度比較,見圖 1。

對(duì)兩個(gè)檢測波長下 7種蜂蜜的 HPLC圖譜相似度進(jìn)行分析,7種蜂蜜在 256 nm波長下的相似度平均為 0.362±0.275。其中,紫云英蜜和棗花蜜色譜圖相似度最高 (0.663),其次是龍眼蜜和棗花蜜(0.635),洋槐蜜和黨參蜜圖譜相似度最低。在280nm波長下的相似度為 0.352±0.343。其中,圖譜相似度最高的也是紫云英蜜和棗花蜜(0.972),其次是黨參蜜和棗花蜜 (0.829),相似度最低的同樣是洋槐蜜和黨參蜜。

表 2 7種蜂蜜總酚、總黃酮與色度相關(guān)性分析Table 2 Correlations of chemical compositions and color intensity of seven honeys

圖 1 256 nm和 280 nm檢測波長下蜂蜜色譜圖相似度比較Fig.1 S imilarity comparison of chromatography of honeys at 256 nm and 280 nm detection wavelength

經(jīng)過與標(biāo)樣對(duì)比保留時(shí)間和紫外吸收光譜,確定 7種蜂蜜中所含對(duì)照品種類及含量,結(jié)果見表 3。由表 3可知,7種蜂蜜均含有 3,4-二甲氧基肉桂酸、肉桂酸、楊梅酮、白楊素、生松素和阿魏酸,均不含有沒食子酸和咖啡酸,香豆酸和槲皮素含量較低,柚皮素和 4,5,7-三羥黃烷酮含量較高;菲瑟酮、香豆酸、兒茶素和木犀草素是多數(shù)樣品含有的成分。α-兒茶素、柚皮素、芹菜素、異鼠李素在各樣品中的出現(xiàn)頻率較低,α-兒茶素僅存在于土黃連蜜和龍眼蜜中,柚皮素僅存在于土黃連蜜和野桂花蜜中,芹菜素僅存在于龍眼蜜和野桂花蜜中,異鼠李素僅存在于土黃連蜜中。Lihu等[9]采用 HPLC方法對(duì)澳大利亞和新西蘭的蜂蜜研究結(jié)果表明,多數(shù)蜂蜜中含有楊梅酮、槲皮素、木犀草素、3,4-二甲基氧基肉桂酸和一種未知類黃酮,與本文結(jié)果較為相似,均含有楊梅酮和 3,4-二甲基氧肉桂酸。Robert等[8]同樣采用HPLC法測定結(jié)果卻與本文差異較大,Robert測定的所有樣品中均含有香豆酸、阿魏酸、沒食子酸、龍膽酸、咖啡酸、柚皮素、莰菲素、4,5,7-三羥黃烷酮和槲皮素,且香豆酸含量較高,在百里香蜜中槲皮素含量特別高。蜜源植物和產(chǎn)地不同可能是造成這些差異的原因。

表 3 7種蜂蜜中各對(duì)照品含量 (mg/g honey)Table 3 Content of standards in seven honeys

-:未檢測到。Not detected.

2.3 7種蜂蜜的總抗氧化性和清除 DPPH·自由基活性的測定結(jié)果

7種蜂蜜的總抗氧化性和清除 DPPH·自由基活性的測定結(jié)果見表 4?？偪寡趸芰颓宄?DPPH·自由基能力線性方程相關(guān)系數(shù)顯示,蜂蜜濃度與總抗氧化能力、清除 DPPH·自由基能力線性關(guān)系良好。根據(jù) Dina所述[10],利用普魯士蘭法測定總抗氧化劑活性時(shí),反應(yīng)液吸光值越大,抗氧化活性越強(qiáng),即抗氧化劑濃度與吸光值線性關(guān)系斜率越大,其抗氧化能力越強(qiáng)。利用清除 DPPH·自由基法測定抗氧化性時(shí),I C50值越小,表明對(duì) DPPH·.清除效果越強(qiáng)。7種蜂蜜中棗花蜜總抗氧化能力和清除DPPH·自由基能力最強(qiáng),分別為 1.9712和 1.321;最弱的為洋槐蜜,分別為 1.0736和 15.714。

表 4 7種蜂蜜總抗氧化能力及清除DPPH·自由基能力Table 4 Total antioxidant activities and DPPH· radical scavenging activities of seven honeys

2.4 蜂蜜化學(xué)組成及抗氧化活性之間的關(guān)系分析

7種蜂蜜抗氧化活性與其化學(xué)組成相關(guān)性分析結(jié)果見表 5。由表 5可知,蜂蜜總抗氧化能力與總酚含量相關(guān)性極顯著,說明總酚含量越高,蜂蜜總抗氧化能力越強(qiáng)。蜂蜜總抗氧化能力與清除DPPH·自由基 IC50負(fù)相關(guān)性顯著,說明總抗氧化能力越強(qiáng),清除DPPH·自由基的活性越高。

本文測得,抗氧化能力方面,洋槐蜜最弱,棗花蜜最強(qiáng)。整體上表現(xiàn)出蜂蜜顏色越深,總酚與總黃酮含量越高,抗氧化能力越強(qiáng),這與 Robert[8]、Jasna[5]和 A.M.Aljadi等[4]結(jié)論相似。對(duì) 7種蜂蜜進(jìn)行市場調(diào)查,發(fā)現(xiàn)其售價(jià)不一,顏色最淺的洋槐蜜價(jià)格最高,而顏色最深的棗花蜜價(jià)格居中。因此,本文為消費(fèi)者如何選購優(yōu)質(zhì)的蜂蜜提供了一些參考。

表 5 蜂蜜化學(xué)組成與抗氧化活性相關(guān)性Table 5 Correlations of compositions and antioxidant activities of honey

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Chem ical Compositions and Antioxidant Activities of Seven Honeys from D ifferent Floral Sources

GUO Xia-li1,LUO Li-ping1＊,LENG Ting-ting1,FU Ting1,D ING Hong-xiu2

1School of Life Science and Food Engineering,Nanchang University,Nanchang 330031,China2School of Life Science,Jiangxi Nor m al University,Nanchang 330022,China

Chemical compositions and antioxidant activities of seven common honeys in China were researched and the relationships be tween them were studied in the paper.Spectrophotography was used to determine color intensity,total phenol,total flavonoids of honeys.Twenty-three phenolic compoundswere selected as standards for high performance liquid chromatographymethod(HPLC)to detect the phenolic compounds of honeys.The antioxidant activities,including the radical scavenging assay and total antioxidant power,were deter mined by DPPH· radical scavenging assay and Prussian blue spectrophotometry respectively.The resultsof the study showed that totalphenol and flavonoids content and color intensitywere different remarkably among different honeys.The higher the color intensity was,the higher the total phenol and flavonoids content in honeyswere.The correlations between the totalphenol content and antioxidant activities were significantly remarkable(R2=0.881＊＊).In general,the darker honeys exhibited a higher antioxidant activities and contained higher total phenol compounds and flavonoids.

honey;total phenol;total flavonoids;total antioxidant activity;radical scavenging activity

0629.9

A

1001-6880(2010)04-0665-06

2009-07-20 接受日期:2010-01-06

國家自然科學(xué)基金 (C30700105);江西省青年科學(xué)家(井岡之星)培養(yǎng)計(jì)劃資助(S00590)

＊通訊作者 Tel:86-791-3969519;E-mail:lluo2@126.com