香螺血清、肌肉和唾液腺凝集素凝集性能的初步研究

陳 琳,許高云,饒小珍,陳寅山

福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,福建閩侯 350108

香螺血清、肌肉和唾液腺凝集素凝集性能的初步研究

陳 琳,許高云,饒小珍,陳寅山＊

福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,福建閩侯 350108

研究香螺 (Naptunea cum ingicrosse)肌肉、血清和唾液腺凝集素對(duì) 7種脊椎動(dòng)物紅細(xì)胞、人的 4種紅細(xì)胞、4種單細(xì)胞藻類和 11種微生物細(xì)胞的凝集性能,同時(shí)進(jìn)行 pH敏感性、熱穩(wěn)定性、糖抑制性、EDTA、金屬離子以及鹽濃度影響試驗(yàn)。結(jié)果表明,3種凝集素對(duì)各種細(xì)胞的凝集效應(yīng)存在差異,以家兔紅細(xì)胞的凝集效果最佳。肌肉和血清凝集素在 pH＜7.0時(shí)均失活,唾液腺凝集素的熱穩(wěn)定性最強(qiáng),溫度為 90℃仍具有活性。此外,不同的糖溶液對(duì)3種凝集素凝集效果的影響不同,在 EDTA濃度為2.00～0.25 mmol/L范圍內(nèi),3種凝集素的凝集效價(jià)均受到不同程度的抑制。在金屬離子影響試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),Zn2+能明顯提高肌肉和血清凝集素的凝集活力,而對(duì)唾液腺凝集素有抑制的作用。當(dāng)鹽濃度為 12～18 g/L時(shí),可增加香螺肌肉凝集素的凝集效價(jià),而當(dāng)濃度為 24～60 g/L時(shí)卻會(huì)抑制肌肉凝集素的凝集活性。

香螺;凝集素;凝集活力;性質(zhì)

凝集素是一類具有糖結(jié)合專一性的糖蛋白或蛋白質(zhì),其不僅能夠區(qū)分不同的單糖,同時(shí)能夠特異性連接不同低聚糖,檢測(cè)糖復(fù)合物結(jié)構(gòu)的細(xì)微不同[1],這使它們成為生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的有用工具[2]。凝集素廣泛存在于生物體中,目前在動(dòng)物、植物、微生物中均有發(fā)現(xiàn),其中以植物凝集素的研究最早、最多,近年來由于發(fā)現(xiàn)凝集素在無脊椎動(dòng)物中具有重要的作用[3],無脊椎動(dòng)物凝集素逐漸成為研究的熱點(diǎn)。

香螺 (N.cum ingicrosse)是屬于腹足綱 (Gastropoda),前鰓亞綱 (Prosobranchia),狹舌目 (Stenoglossa),蛾螺科 (Buccinidae)的溫帶海水螺類,是我國(guó)沿海重要的海產(chǎn)螺類,個(gè)體大,足部肌肉肥大,有較大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,其凝集素研究至今未見報(bào)道。本文從香螺血清、足部肌肉、唾液腺中提取凝集素,研究其對(duì) 7種脊椎動(dòng)物紅細(xì)胞、人的 4種紅細(xì)胞、4種單細(xì)胞藻類和 11種微生物細(xì)胞的凝集性能,同時(shí)進(jìn)行pH敏感性、熱穩(wěn)定性、糖抑制、EDTA、金屬離子以及鹽濃度影響試驗(yàn),為尋找凝集素來源及探討凝集反應(yīng)發(fā)生的復(fù)雜生理機(jī)制提供基礎(chǔ)資料,也為進(jìn)一步的分離純化凝集素、開發(fā)凝集素的新來源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

香螺購自福州市西營(yíng)里農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。家兔 (O ryctolagus cuniculus)由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房提供,家雞(Gallus gallus),半番鴨(Carina m oschata),家鴿(Colum ba livia dom estica),鵪鶉(Coturnix coturnix),白鰱(Hypophtha lm ichthys m olitrix)等 5種動(dòng)物血樣取自福州市閩侯上街農(nóng)貿(mào)市場(chǎng),小鼠(M us m usculus)由福建師范大學(xué)發(fā)育生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供,人的A型、B型、AB型、O型等 4種血樣的全血由福州市第二醫(yī)院提供。各種單細(xì)胞藻類由福建師范大學(xué)藻類學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供,微生物菌種由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 凝集素的制備

將香螺洗凈,用濾紙吸干其表面水分,砸開螺殼,收集其血液以 8000 r/min,4℃離心 20 min,離心后取上清液,為血清凝集素,4℃保存?zhèn)溆?。另外分別取下肌肉、唾液腺,組織搗碎機(jī)充分搗碎后放入燒杯,按 1:1(v/v)加入 PBS緩沖液,攪拌后用保鮮膜封口,4℃靜置過夜。第二天取出分別以 10000 r/ min,和 15000 r/min 4℃離心 20 min,然后分別取上清液即為肌肉凝集素和唾液腺凝集素,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定 3種凝集素的蛋白質(zhì)含量,以結(jié)晶牛血清蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.4 凝集實(shí)驗(yàn)

1.4.1 動(dòng)物和人血細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物血樣(用 3.8%檸檬酸鈉抗凝)以及人的A型、B型、AB型、O型等4種血樣的全血經(jīng)1500 r/ min離心 5 min除去血漿,用生理鹽水離心洗滌 3次,再用生理鹽水配制成體積分?jǐn)?shù)為 2%的細(xì)胞懸浮液,供實(shí)驗(yàn)用。

凝集反應(yīng)在 96孔V型微量血凝板中進(jìn)行。先在每孔中加入 25μL生理鹽水,再往第一孔中加入25μL凝集素,混勻后,從第一孔中吸取 25μL加入第二孔中,以此類推做倍比稀釋,最后在每孔中分別加入 25μL 2%紅細(xì)胞懸浮液,以 25μL的生理鹽水作對(duì)照,均勻搖動(dòng) 1 min,在室溫下靜置 2 h,肉眼或顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.4.2 單細(xì)胞藻類的凝集實(shí)驗(yàn)

海產(chǎn)小球藻 (Chlorella vulgaris)、心形扁藻(Platym onas cordifor m is)、云微藻(Chlorella sp.)、金藻(Porphyridium purpureum)用無菌海水離心洗滌 2次再稀釋配成藻類細(xì)胞懸液,最終濃度為 8.0×106個(gè)∕mL。凝集實(shí)驗(yàn)在雙凹片上進(jìn)行,先取 40μL樣品,然后再加入等量的單細(xì)胞藻懸液,混勻 2 h后鏡檢結(jié)果。用等量的無菌海水代替樣品溶液作為對(duì)照。

1.4.3 細(xì)菌和真菌的凝集實(shí)驗(yàn)

大腸桿菌 (Escherichia coli.)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(B acillus subtilis)、甘薯薯瘟病原細(xì)菌(Fasarium axyssporam)、綠膿桿菌(Pseudom onas eruginosa)用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基活化,以 0.85%無菌生理鹽水配成終濃度為108個(gè) /mL的菌懸液。青霉 (Penicilliumchrysogenum.)、黑曲霉(Aspergillus niger)、根霉(Rhizopus stolonoifer.)、玉米大斑病菌(Helm inthos porium)、稻瘟病病菌(Piricularia oryzae)則用孟加拉紅培養(yǎng)基活化,再以無菌生理鹽水配成 108個(gè)/mL的孢子懸液。凝集實(shí)驗(yàn)在雙凹片上進(jìn)行,方法同上,針對(duì)不同的菌種,分別用等量的無菌生理鹽水代替樣品溶液作為對(duì)照。

1.5 理化性質(zhì)實(shí)驗(yàn)

1.5.1 溫度和 pH敏感性實(shí)驗(yàn)

3種凝集素各用 EP管分裝 7管,再分別放入30、40、50、60、70、80、90℃恒溫水浴鍋中 15 min,在V型微量血凝板中進(jìn)行倍比稀釋,用家兔紅細(xì)胞懸浮液檢測(cè)其凝集活性的變化情況,以不做任何處理的樣品做對(duì)照。

把各凝集素 pH調(diào)至 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0,4℃放置 2 h后,再將各溶液的pH調(diào)回7.2,然后在V型微量血凝板中測(cè)定各樣品的凝集活力。需以未處理過的樣品做對(duì)照。

1.5.2 糖抑制實(shí)驗(yàn)

將D-葡萄糖(D-glucose)、蔗糖(Sucrose)、D-半乳糖 (D-galactose)、D-乳糖 (D-lactose)、D-甘露糖(D-m annose)、D-樹膠醛糖 (D-A rabinose)、木糖(Xy-lose)、果糖(Fructose)、麥芽糖(M altose)等 9種糖配成濃度均為 0.2 mol/L的糖溶液。在V型微量血凝板中將 3種凝集素進(jìn)行倍比稀釋后,向每孔中各加入 25μL的糖溶液,均勻搖動(dòng) 1 min,靜置 1 h后再加入25μL的家兔紅細(xì)胞懸浮液,2 h后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。用生理鹽水代替糖溶液作空白對(duì)照。

1.5.3 EDTA、金屬離子和鹽度的影響實(shí)驗(yàn)

用 EDTA的鈉鹽配置濃度分別為 2.00、1.00、0.50、0.25 mmol/L的 EDTA溶液,凝集實(shí)驗(yàn)方法同糖抑制實(shí)驗(yàn),觀察不同濃度的 EDTA對(duì)凝集性能的影響。以生理鹽水代替 EDTA溶液作為空白對(duì)照組。

用 CaCl2、ZnCl2、MnCl2·4H2O和MgCl2·6H2O分別配成濃度為 0.01 mol/L的溶液,方法同上,觀察不同金屬離子對(duì)凝集性能的影響。用生理鹽水代替金屬溶液作空白對(duì)照。

將樣品用鹽度為 6、12、18、24、30、36、48(g/L)等不同濃度的鹽水進(jìn)行倍稀釋后,檢測(cè)對(duì)兔紅細(xì)胞的凝集活性。以生理鹽水代替鹽溶液做對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)含量

所提取的肌肉粗蛋白的濃度為 21.61 mg/mL,血清粗蛋白的濃度為 1.47 mg/mL,唾液腺粗蛋白的濃度為 4.68 mg/mL。

2.2 對(duì)動(dòng)物和人血細(xì)胞的凝集作用

香螺肌肉、血清和唾液腺等 3種凝集素對(duì)11種血細(xì)胞的凝集結(jié)果見表 1,結(jié)果顯示,肌肉和血清凝集素對(duì)兔血的凝集活力最強(qiáng),發(fā)生凝集所需的最低蛋白質(zhì)濃度分別為 0.169 mg/mL和 0.735 mg/mL,肌肉凝集素對(duì)半番鴨、家鴿、鵪鶉的血細(xì)胞無凝集活性,對(duì)小鼠和人的 4種紅細(xì)胞發(fā)生凝集反應(yīng)的所需的最低蛋白質(zhì)濃度在 1.351～2.702 mg/mL之間。血清凝集素只對(duì)兔血和人的 A型血細(xì)胞有凝集活力,唾液腺凝集素對(duì)家雞、半番鴨、家鴿、鵪鶉亦無凝集活力。以后實(shí)驗(yàn)中均以 2%兔血紅細(xì)胞作為指示細(xì)胞。

表 1 香螺 3種凝集素對(duì) 11種紅細(xì)胞的凝集活性Table 1 The agglutinating activities of 3 agglutinins fromN.cum ingicrosse on 11 kinds of erythrocytes

2.3 對(duì)單細(xì)胞藻類和微生物的凝集作用

由表 2和表 3可知,3種凝集素對(duì)不同微生物的凝集效價(jià)不同,肌肉凝集素只對(duì)海產(chǎn)小球藻、金藻發(fā)生凝集,血清凝集素只對(duì)心形扁藻無凝集,唾液腺凝集素則對(duì)各種單細(xì)胞藻類和微生物細(xì)胞均無凝集作用。肌肉凝集素對(duì)綠膿桿菌無凝集作用,對(duì)根霉和稻瘟病病菌有凝集作用。血清凝集素對(duì)真菌也均無凝集作用。

2.4 pH和溫度對(duì)凝集活性的影響

表 2 香螺 3種凝集素對(duì)單細(xì)胞藻類的凝集作用Table 2 The agglutinating activities of 3 agglutinins fromN. cum ingicrosse on alga cells

實(shí)驗(yàn)設(shè)置的 8個(gè) pH(3.0～10.0)和 7個(gè)實(shí)驗(yàn)溫度(30～90℃)對(duì) 3種凝集素凝集活性影響見表 4。結(jié)果顯示,香螺的肌肉和血清凝集素均不耐酸而耐堿,當(dāng) pH ＜7.0時(shí)均失活,而 pH ＞7.0時(shí)都具有活力,其中肌肉凝集素在 pH=8.0時(shí)活性有明顯的提高,發(fā)生凝集的最低蛋白質(zhì)濃度只需 0.006 mg/mL。唾液腺凝集素表現(xiàn)出很強(qiáng)的酸堿耐受性,pH 3.0～ 9.0范圍內(nèi)都具有活性。溫度方面,當(dāng)溫度在 50℃之后,肌肉凝集素開始沒有凝集活力,血清則在 40℃起就無凝集效果,而不同溫度處理后的唾液腺凝集素的凝集活性變化影響不大,其熱穩(wěn)定性最好。

表 3 香螺 3種凝集素凝集微生物細(xì)胞或孢子的活力Table 3 The agglutinating activities on the unicellularmicrobe of 3 agglutinins fromN.cum ingicrosse

表 4 pH和溫度對(duì)香螺 3種凝集素凝集活性的影響Table 4 The effect of the pH and temperature on the agglutinating activities of 3 agglutinins fromN.cum ingicrosse

2.5 糖溶液對(duì)凝集活性的影響

表 5為 9種糖類對(duì) 3種凝集素凝集活力的影響結(jié)果。由表 5可知,供試的 9種糖中,只有 D-甘露糖能抑制肌肉凝集素的活性,而 D-甘露糖卻不能抑制血清和唾液腺凝集素的活性。各種糖溶液對(duì)血清凝集素的凝集作用均無抑制效果。此外,D-樹膠醛糖和D-乳糖可抑制唾液腺凝集素的凝集作用。

表 5 糖溶液對(duì)香螺 3種凝集素凝集活性的影響Table 5 The effect of the glycose solution on the agglutinating activities of 3 agglutinins fromN.cum ingicrosse

“+”表示有抑制用用;“-”表示無抑制作用?！?”is having agglutinating activities;"-”is no agglutinating activities.

2.6 金屬離子和鹽度對(duì)凝集活性的影響

EDTA對(duì) 3種凝集素凝集活力的影響見表 6。由表 6可知,經(jīng)過不同濃度的 EDTA處理,3種凝集素的凝集活力受到不同程度的抑制,當(dāng) EDTA濃度為 2.00 mmol/L時(shí),肌肉凝集素發(fā)生凝集所需的最低蛋白質(zhì)濃度在 0.169～2.702 mg/mL之間,當(dāng) EDTA濃度的降低至 0.50 mmol/L時(shí),發(fā)生凝集所需的最低蛋白質(zhì)濃度升為 10.805 mg/mL,凝集活力降低。還可以看出血清和唾液腺凝集素也受到不同程度的抑制。

4種金屬離子對(duì) 3種凝集素凝集家兔紅細(xì)胞的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表 6。由表 8可以看出,4種金屬離子中 Zn2+能明顯提高肌肉和血清凝集素對(duì)家兔紅細(xì)胞的凝集活力,而對(duì)唾液腺凝集素反而有抑制的作用。而Mn2+、Mg2+和 Ca2+對(duì) 3種凝集素的凝集活性沒有明顯的影響。

表 6 EDTA及金屬離子對(duì)香螺 3種凝集素對(duì)家兔紅細(xì)胞凝集活性的影響Table 6 The agglutinating activities of 3 agglutinins fromN.cum ingicrosse on different densities of EDTA and metal ions

鹽度對(duì)香螺的肌肉凝集素的凝集活性具有一定的影響,而對(duì)香螺血清和唾液腺凝集素的凝集效價(jià)影響不明顯,見表 7,當(dāng)鹽度為 12 g/L時(shí),肌肉凝集素發(fā)生凝集所需的最低蛋白質(zhì)濃度為 0.042 mg/ mL,從鹽度為 24 g/L起就是起到抑制作用,同比之下,血清和唾液腺凝集素受鹽度的影響不大,血清凝集素的凝集作用所需的最低蛋白質(zhì)濃度在 0.368～0.735 mg/mL間波動(dòng),而唾液腺凝集素則在 0.585～1.170 mg/mL之間。

阿拉伯?dāng)?shù)字表示樣品溶液產(chǎn)生凝集反應(yīng)的最低蛋白質(zhì)濃度(mg/mL);“-”表示無凝集反應(yīng)。The arabic figures isminimum level of apolipoprotein on agglutinating activities(mg/mL);"-”is no agglutinating activities.

3 討論

3.1 細(xì)胞凝集作用是凝集素最重要的生物學(xué)功能之一,它是基于凝集素分子與細(xì)胞表面糖分子的專一性結(jié)合。早在 20世紀(jì)初,Landsteiner和 Raubitschek就證明了凝集素的血凝作用具有供血?jiǎng)游锓N屬專一性,同時(shí)還與血型有關(guān)。之后又發(fā)現(xiàn),凝集素除了凝集紅細(xì)胞外,對(duì)某些微生物細(xì)胞、精子、骨髓細(xì)胞、胚胎來源的細(xì)胞甚至是癌細(xì)胞也具有凝集作用[4-7]。

本實(shí)驗(yàn)分別從香螺的肌肉、血清和唾液腺中提取凝集素,這 3個(gè)不同來源的凝集素對(duì) 11種脊椎動(dòng)物血細(xì)胞、4種單細(xì)胞藻類以及 11種微生物細(xì)胞的凝集性能存在著較大的差異,表明香螺體內(nèi)含有不同的凝集素,這和許高云等[8]對(duì)蚶形無齒蚌凝集素的研究結(jié)果相似。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 3種凝集素均對(duì)兔紅細(xì)胞的凝集活力較強(qiáng),這和 Fabregas[9]、Ainouz[10]、陳寅山[11]等得出的結(jié)論一致。而同種凝集素對(duì)不同的紅細(xì)胞凝集程度呈現(xiàn)差異,這和薛江楠[12]、梁青龍[13]等研究的結(jié)果相似。這些差異主要與凝集素分子的大小、糖結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量和細(xì)胞分子表面的特性等有關(guān)[4]。當(dāng)某種凝集素與某種紅細(xì)胞不發(fā)生凝集時(shí),則說明該紅細(xì)胞表面不存在與這種凝集素專一性結(jié)合的糖分子。如本實(shí)驗(yàn)中,3種凝集素均對(duì)半番鴨、家鴿和家雞的紅細(xì)胞不發(fā)生凝集作用。此外,本研究中,受試的微生物細(xì)胞對(duì)香螺的 3種凝集素的凝集反映敏感性較低,僅專一的對(duì)某些微生物具有凝集作用。這與 Bird等[14]早期研究藻類凝集素對(duì)細(xì)菌的凝集作用的結(jié)果相似。張嵐等[15]認(rèn)為唾液凝集素主要通過識(shí)別細(xì)菌表面蛋白來介導(dǎo)細(xì)菌的凝集或黏附。3種凝集素對(duì)微生物的凝集活性的不同,除了凝集素本身的不同引起外,還可能與這些細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)和細(xì)胞外產(chǎn)物有關(guān),同時(shí)還可能與這些微生物自身的運(yùn)動(dòng)習(xí)性和生活習(xí)性等有關(guān),這還有待于進(jìn)一步研究。本研究將為凝集素在不同類型細(xì)胞表面糖分子特征及細(xì)胞鑒別等方面的研究提供理論的依據(jù),同時(shí)對(duì)弄清螺類病原微生物的致病機(jī)理提供幫助。

3.2 香螺的肌肉,血清和唾液腺 3種凝集素的 pH值的適應(yīng)范圍存在著差異,肌肉和血清凝集素比較相近,在 pH 7.0～10.0上具有凝集活性,而唾液腺凝集素則具有更廣的適應(yīng)范圍,pH 3.0～9.0均表現(xiàn)出凝集活性。這表明了,不同的凝集素保持凝集活性的 pH范圍不同,這與許多研究的結(jié)果相似,如三角帆蚌肌肉凝集素在 pH 6.0～8.0普遍表現(xiàn)出較強(qiáng)的凝集活性[16],九孔鮑血清凝集素的活性在 pH 6.0～12.0,凝集活性沒有變化[17],日本對(duì)蝦(Penaeus japonicus)的凝集素活性在 pH 5.0～7.5時(shí)穩(wěn)定,pH 8.0～9.0時(shí)迅速下降[18]。導(dǎo)致這些差異一方面可能是因?yàn)?pH的變化影響溶液中離子鍵的相互作用,從而影響凝集素表面的發(fā)生變化,導(dǎo)致凝集活性的改變,另一方面可能是因?yàn)楫?dāng) pH處在與動(dòng)物內(nèi)環(huán)境相近的酸堿度時(shí),表現(xiàn)出較強(qiáng)的凝集活性,這只是一種正常反應(yīng)。此外受試細(xì)胞的代謝狀態(tài)和表面電荷也可能是影響凝集反應(yīng)的一個(gè)原因[19]。

熱穩(wěn)定性方面,3種凝集素耐熱性不同,60℃開始肌肉凝集素開始沒有凝集活力,血清則在40℃起就已無凝集活性,而唾液腺凝集素表現(xiàn)出強(qiáng)的熱穩(wěn)定性,這可能是和凝集素分子中蛋白質(zhì)和糖的含量不同有關(guān)[20]。受熱后的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變進(jìn)而失活,這可能是凝集素失活的最主要的原因,糖耐熱性好,含糖量高的凝集素其熱穩(wěn)定性就可能較好,由此可以推斷唾液腺凝集素的含糖量可能最高。另外,也可能和凝集素的活性位點(diǎn)有關(guān),還可能和香螺的棲息環(huán)境溫度有關(guān).[21]。

3.3 凝集素有選擇地對(duì)異物產(chǎn)生凝集反應(yīng),主要是由于凝集素帶有特異性的糖基決定簇的受體[22]。糖類特別是單糖,有時(shí)二糖、三糖或者多糖,能對(duì)凝集素的凝集反應(yīng)起到抑制的作用[23],這在很多的研究中都得到了證實(shí),如麗文蛤的血清凝集活性被 D-甘露糖、D-麥芽糖抑制[24];背角無齒蚌和三角帆蚌的血清凝集素可被多種單糖抑制[12]。但饒小珍[17]等對(duì)九孔鮑血清凝集素進(jìn)行的糖抑制實(shí)驗(yàn)卻發(fā)現(xiàn)10種糖溶液對(duì)凝集效果均沒有抑制作用。王新生[21]等發(fā)現(xiàn)褶紋冠蚌肌肉凝集素不能被受試的 7種糖所抑制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),只有 D-甘露糖抑制了香螺肌肉凝集素的凝集活性,其余的均無抑制作用。各種糖溶液對(duì)血清凝集素的凝集作用均無抑制效果。這可能是由于這 3種凝集素表面的糖基結(jié)合位點(diǎn)與這些不發(fā)生抑制作用的糖之間不存在親合性。相反,能發(fā)生抑制作用的糖,則可被認(rèn)為其結(jié)構(gòu)互補(bǔ)于所作用的凝集素,進(jìn)而確定凝集結(jié)合部位對(duì)糖的特異性。

3.4 一些二價(jià)金屬離子的參與往往有助于多種凝集素的凝集作用[25],因此 EDTA可能會(huì)強(qiáng)烈抑制凝集素的活力,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,香螺的 3種凝集素受EDTA不同程度的抑制,這與牟海津等[26]的研究結(jié)果一致。說明這 3種凝集素分子中均含有維持活性所必需的一種或多種金屬離子,實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明了, Mn2+、Mg2+和 Ca2+對(duì) 3種凝集素的凝集活性沒有明顯的影響,即無信賴性。而只有 Zn2+能明顯提高肌肉和血清凝集素對(duì)家兔紅細(xì)胞的凝集活力。這可能就是由于這 3種凝集素的凝集作用不需要Mn2+、Mg2+和 Ca2+的參與,而肌肉和血清凝集素的凝集作用卻與 Zn2+有很大的關(guān)系。再次說明了無脊椎動(dòng)物凝集素的凝集作用常常需要一些二價(jià)金屬離子的參與[27]。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),在一定范圍內(nèi)的鹽度可以改變香螺肌肉凝集素的凝集效價(jià)。在鹽度為 12～18 g/L之間可提高香螺肌肉凝集素的凝集活性, Tamplin[28]等在研究美洲巨蠣的血清對(duì)霍亂弧菌的凝集作用發(fā)現(xiàn)適當(dāng)增加反應(yīng)液的鹽度 24～30 g/L,可以提高凝集效價(jià)。牟海津等[26]發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)增加鹽度可提高中國(guó)對(duì)蝦血淋巴的凝集效價(jià)的研究結(jié)果相似,而在鹽度為 24 g/L以上,活性效價(jià)就開始下有所下降。這其中的原由還有待進(jìn)一步的研究。

通過對(duì)香螺的肌肉、血清和唾液腺凝集素的比較研究,發(fā)現(xiàn)三者的性質(zhì)等方面存著著較大的差異,所以要進(jìn)一步的了解三者具體的類型、物理化學(xué)結(jié)構(gòu)等,還有待分離純化等的深入研究。

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A Prel im inary Study on Agglutination of Agglutin ins of Serum,M uscular and Salivary Gland fromNaptunea cum ingicrosse

CHEN Lin,XU Gao-yun,RAO Xiao-zhen,CHEN Yin-shan＊
College of Life Sciences,Fujian Nor m alUniversity,Fuzhou 350108,China

Serum,muscular and salivary gland agglutinins extracted fromNaptunea cum ingicrossewere tested for agglutinating activities using 7 kinds of an imal erythrocytes,4 kinds of human erythrocytes,4 species of unicellular algae,and 11 species ofmicrobe.Meanwhile the sensibility of pH,thermostability,sugar-inhibiting action,the effect of EDTA,metal hydronium and salinitywere detected.The results showed that therewere differences in the agglutinating activitieson various cells in 3 agglutinins,and the rabbit erythrocyteswere the most sensitive to 3 agglutinins.The agglutinating activities ofmuscule and serum agglutininswere disappeared in pH＜7.0 condition.The thermostability of salivary gland agglutinin was the highest,stillwith activities at 90℃.Besides,3 agglutinins showed different results in the sugar-inhibiting experiments.The agglutinating activities of 3 agglutininswere inhibited in the range of 2.00-0.25 mmol/L EDTA.It was found that Zn2+could improve the agglutinating activities ofmuscle and serum agglutinins,but restrain the salivary gland agglutinin.When the salt concentration was at 12-18 g/L,the muscle agglutinin agglutination could be increased, and itwas be inhibited at the concentration of 24-60 g/L.

Naptunea cum ingicrosse;agglutinin;agglutinating activity;characteristics.

R284.2

A

1001-6880(2010)04-0651-08

2009-10-12 接受日期:2010-04-08

福建省科技廳資助項(xiàng)目(2005K018)

＊通訊作者 Tel:86-591-22868216;E-mail:biocys@163.com