胡椒堿及其衍生物對 SH-SY5Y細胞的保護作用研究

穆麗華,劉 屏＊,胡 園,廖紅波,李佳佳

1中國人民解放軍總醫(yī)院藥理研究室,北京 100853;2安徽蚌埠醫(yī)學(xué)院,蚌埠 233003

胡椒堿及其衍生物對 SH-SY5Y細胞的保護作用研究

穆麗華1,劉 屏1＊,胡 園1,廖紅波1,李佳佳2

1中國人民解放軍總醫(yī)院藥理研究室,北京 100853;2安徽蚌埠醫(yī)學(xué)院,蚌埠 233003

對胡椒堿進行結(jié)構(gòu)改造,合成了 4個胡椒堿衍生物。以高濃度皮質(zhì)酮 (corticosterone)模擬抑郁及焦慮癥神經(jīng)細胞損傷狀態(tài)。對包括胡椒堿在內(nèi)的 5個化合物進行了 SH-SY5Y細胞保護作用的研究。結(jié)果表明:胡椒堿、5-(3,4-methylenedioxy phenyl)-2E,4E-pentadienoic acid n-propylamine amide(2)以及 5-(3,4-methylenedioxy phenyl)-2E,4E-pentadienoic acid N-methyl piperazine amide(4)對 SH-SY5Y細胞有較好的保護作用。其中化合物2對 SH-SY5Y細胞具有明顯和持久的保護作用。

胡椒堿;胡椒堿衍生物;結(jié)構(gòu)修飾;SH-SY5Y

抑郁屬于情感障礙性疾病,其發(fā)病率逐年增加,對人類的健康和生命已構(gòu)成威脅,并引起了人們的廣泛重視。關(guān)于抑郁的發(fā)病機理和藥物治療機制,人們提出了中樞神經(jīng)遞質(zhì)假說,認為腦內(nèi)單胺類遞質(zhì)功能紊亂與抑郁發(fā)病有關(guān)。植物藥作為具有悠久歷史的天然藥物來源,在抑郁病的治療中正發(fā)揮著越來越重要的作用。

胡椒堿 (piperine)屬于桂皮酞胺類生物堿,在自然界中存在廣泛,尤其在胡椒科植物中大量存在[1],胡椒堿的藥理作用較為廣泛,目前已發(fā)現(xiàn)具有有抗氧化[2]、免疫調(diào)節(jié)[3]、抗腫瘤[4]、促進藥物代謝[5]等作用。近幾年胡椒堿的抗抑郁作用逐漸被發(fā)現(xiàn)和報道,李崧等研究發(fā)現(xiàn)胡椒堿能夠升高腦內(nèi)5羥色胺水平,具有較好的抗抑郁作用[6]。L ee SA等報道胡椒堿可以抑制MAO活性,從而表現(xiàn)出強的抗抑郁樣作用[7]。為了進一步開發(fā)利用胡椒堿,我們以胡椒堿為先導(dǎo)化合物對其哌啶環(huán)進行結(jié)構(gòu)修飾合成了 4個衍生物。以高濃度皮質(zhì)酮 (corticosterone)模擬抑郁及焦慮癥神經(jīng)細胞損傷狀態(tài),對包括胡椒堿在內(nèi)的 5個化合物進行了 SH-SY5Y細胞保護作用的研究。

1 試驗部分

1.1 儀器與材料

MultiskanMK3酶標(biāo)儀 (美國);生物倒置顯微鏡(重慶光電儀器有限公司 XDS-1B);CO2氣瓶 (北京華宇辰氣體有限公司);CO2減壓器 (上海三友儀器廠);pH計 (葡萄牙 HANNA pH211)噻唑藍[methyl thiazolyl tetrazolium,MTT](Merck產(chǎn)品); DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司);馬血清和胎牛血清(北京索萊寶科技有限公司);皮質(zhì)酮 (美國 Sigma公司);地昔帕明(美國 Sigma公司);SH-SY5Y細胞株由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。

1.2 方法

1.2.1 胡椒堿衍生物制備

以胡椒堿為起始原料,胡椒堿在堿性條件下水解為胡椒酸,胡椒酸與氯化亞砜發(fā)生酰氯化反應(yīng),再與胺類化合物反應(yīng)得到相應(yīng)的 3個胡椒酰胺類產(chǎn)物(2～4),另外,胡椒酸在酸性條件下與甲醇發(fā)生酯化反應(yīng),生成胡椒酸甲酯。這兩個反應(yīng)收率較高,操作簡單,是實驗室常用的反應(yīng)。

圖 1 胡椒堿衍生物的合成路線Fig.1 Synthesis of derivatives of piperine

1.2.2 細胞培養(yǎng)和檢測

將 SH-SY5Y細胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)為 10%馬血清的 DMEM培養(yǎng)液中,置于 37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的 CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng),每隔 2～3 d換培養(yǎng)液 1次。

陽性藥地昔帕明的配制:精密稱取地昔帕明0.30 mg,用空白DMEM稀釋至 20 mL,得濃度為 50 μmol/L,用無菌濾頭過濾除菌,保存于 4℃冰箱避光備用。給藥時,地昔帕明加入 96孔板中每孔 10 μL,每孔終體積為 100μL,則地昔帕明終濃度為 5 μmol/L。

取對數(shù)生長期細胞,消化后充分吹打成單細胞懸液,計數(shù)后稀釋成 1×105Cell/mL,接種到 96孔培養(yǎng)板中(每孔100μL),分別加入濃度為2、20、200 μmol/L的藥液,每個濃度設(shè) 5個復(fù)孔,每孔 10μL,之后加入 4000μmol/L皮質(zhì)酮 10μL每孔。空白孔加入20μL DMEM,對照孔中加入 10μL DMEM后加入 10μL濃度為 4000μmol/L的皮質(zhì)酮,陽性藥孔加入10μL濃度為50μmol/L地昔帕明后加入10 μL濃度為 4000μmol/L的皮質(zhì)酮然后放入培養(yǎng)箱。培養(yǎng) 24和 48 h后,棄去培養(yǎng)液,每孔加入新鮮配置的含 5 mg/mL MTT的無血清培養(yǎng)基,37℃下繼續(xù)培養(yǎng) 4 h后,離心,除去上清液,每孔加入DMSO 150 μL待藍色顆粒完全溶解,置微量振蕩器上振蕩 5 min使其充分溶解。在酶標(biāo)儀上測定 570 nm波長處的吸光度 (A570nm)值,用于定量反映活細胞數(shù)。

1.2.3 統(tǒng)計處理

2 結(jié)果

2.1 胡椒堿及其衍生物對皮質(zhì)酮造成的 SH-SY5Y細胞損傷的影響

與模型組相比較,在皮質(zhì)酮損傷 24 h后,化合物 2高劑量組對 SH-SY5Y細胞有明顯的保護作用。皮質(zhì)酮損傷 48 h后,胡椒堿高劑量組,化合物 2高劑量組和化合物 4中劑量組對 SH-SY5Y細胞有明顯的保護作用。本實驗結(jié)果表明胡椒堿的衍生物化合物 2對 SH-SY5Y細胞具有明顯和持久的保護作用。結(jié)果見表 1。

表 1 胡椒堿及其衍生物對皮質(zhì)酮損傷的 SH-SY5Y細胞的影響 (±s,n=5)Table 1 Effects of Piperine and its derivatives on corticosterone-injured SH-SY5Y cell(±s,n=5)

表 1 胡椒堿及其衍生物對皮質(zhì)酮損傷的 SH-SY5Y細胞的影響 (±s,n=5)Table 1 Effects of Piperine and its derivatives on corticosterone-injured SH-SY5Y cell(±s,n=5)

組別 Group 劑量 (μmol/L)A570nm(24 h)A570nm(48 h)空白 – 2.43±0.30 2.28±0.35對照(皮質(zhì)酮) 400 1.34±0.22b1.62±0.24b地昔帕明 5 1.63±0.14a1.91±0.11a2 1.40±0.13 1.78±0.21皮質(zhì)酮 +胡椒堿 20 1.57±0.09 1.73±0.11 200 1.31±0.13 1.93±0.08a2 1.45±0.10 1.56±0.13皮質(zhì)酮 +化合物 1 20 1.22±0.25 1.47±0.13 200 1.17±0.18 1.37±0.19 2 1.29±0.19 1.57±0.13皮質(zhì)酮 +化合物 2 20 1.26±0.09 1.46±0.34 200 1.66±0.21a1.94±0.17a2 1.35±0.21 1.34±0.13皮質(zhì)酮 +化合物 3 20 1.46±0.13 1.48±0.26 200 1.50±0.17 1.46±0.20

注:與對照 (皮質(zhì)酮)組比較,aP＜0.05,與空白組比較,bP＜0.01。Compaired with model group,aP＜0.05,Compaired with normal control group,bP＜0.01.

3 結(jié)果與討論

臨床研究表明,焦慮和抑郁癥患者的下丘腦-垂體-腎上腺 (HPA)軸功能亢進,血中糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids,GC)水平顯著升高[8]。人的腦神經(jīng)細胞上存在介導(dǎo) GC作用的受體,其中海馬表達水平最高[9]。HPA軸功能亢進時海馬 GC受體由于血中 GC水平持續(xù)升高而下調(diào),從而使海馬對 HPA軸的負反饋障礙,血中高 GC水平得以維持[10]。抑郁等精神疾患的發(fā)生可能與過量 GC對海馬的選擇性損傷有關(guān)[11]。

SH-SY5Y細胞系是人神經(jīng)母細胞瘤細胞,是一種分化程度較低的腫瘤細胞,該細胞繁殖快,細胞形態(tài),生理和生化功能與正常神經(jīng)細胞相似,胞體也呈錐體狀,同時具有明顯的軸突。本文根據(jù)文獻方法[12]以高濃度皮質(zhì)酮 (corticosterone)模擬抑郁及焦慮癥神經(jīng)細胞損傷狀態(tài),我們觀察了包括胡椒堿在內(nèi)的 5個化合物在此模型上對 SH-SY5Y細胞的保護作用。實驗結(jié)果表明,胡椒堿高劑量組,5-(3, 4-methylenedioxy phenyl)-2E,4E-pentadienoic acid npropylamine amide(2)高劑量組和 5-(3,4-methylenedioxy phenyl)-2E,4E-pentadienoic acid N-methyl piperazine amide(4)中劑量組對皮質(zhì)酮損傷的 SHSY5Y細胞均有一定的保護作用。

以中藥的活性成分為先導(dǎo)化合物,進行結(jié)構(gòu)修飾改造、研發(fā)新藥是國內(nèi)外藥物化學(xué)家研究的熱點。本試驗合成了 4個胡椒堿衍生物,其中化合物 2對SH-SY5Y細胞保護效果好、作用時間長,其抗抑郁作用優(yōu)于胡椒堿及其他衍生物。胡椒酸與氯化亞砜發(fā)生酰氯化反應(yīng),再與不同的胺類化合物反應(yīng)將會得到一系列胡椒堿的衍生物,以利于構(gòu)建活性篩選的化合物庫,本研究作為一種初步探索,為我國從中藥活性分子經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾研發(fā)新藥提供一點參考。

1 Yuan CQ(袁昌齊).Development and Utilization of Natural Medicinal Resource(天然藥物資源開發(fā)利用).Nanjing: Phoenix Science Press,2000.253-254.

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3 Dogra RK,Khanna S,Shanker R. Immunotoxicological effects of piperine in mice.Toxicology,2004,196:229-236.

4 Pradeep CR,Kuttan G.Effect of piperine on the inhibition of lung metastasis induced B16F-10 melanoma cells in mice.Int-Imm unophar m acol.2004,4:1795-1803.

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6 Li S(李崧),Wang C(王澈),LiW(李巍),et al.Antidepressantent effects of piperine and its derivate,3,4-methylene dioxy cinnamoyl piperidine.J Shenyang Phar m Univ(沈陽藥科大學(xué)學(xué)報),2006,23:392-396.

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12 Liu JG(劉景根),Li R(李瑞),Liu GQ(劉國卿)et al. Effects of daurisoline and its three optical isomers on ischemic injury in cultured pheochromocytoma(PC12)cells.Acta Phar m Sinica(藥學(xué)學(xué)報),1998,33:165-170.

Protective Effect of Piperine and ItsDerivatives on SH-SY5Y Cells

MU Li-hua1,L IU Ping1＊,HU Yuan1,L IAO Hong-bo1,L IJia-jia2

1Departm ent of clinical Phar m acology,Genaral Hosital of PLA,Beijing 100853,China;2Depar tm ent of Phar m acy,Bengbu M edical College,Bengbu 233030,China

The piperinewasmodified and four derivativeswas synthesised.SH-SY5Y cellwas lesion byHigh concertation cort to stimulate the neuro cell in depression or anxiety.Five compounds were screened for protective activity on SHSY5Y.Piperine,5-(3,4-methylenedioxyphenyl)-2E,4E-pentadienoic acid n-propylamine amide(2)and 5-(3,4-methylenedioxy phenyl)-2E,4E-pentadienoic acid N-methyl piperazine amide(4)showed protective activities on SH-SY5Y cells.Compound 2 showed notable protective effect on SH-SY5Y cells from the lesion done by cort.

piperine;derivatives of piperine;structuralmodification;SH-SY5Y

Q946.91;R285

A

1001-6880(2010)03-0408-03

2009-05-04 接受日期:2009-08-05

國家自然科學(xué)基金(30600801)

＊通訊作者 Tel:86-10-66936678;E-mail:liuping126@126.com