有氧訓(xùn)練對(duì)阿爾茨海默病模型大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡的影響

金華鋒,萬(wàn) 琪,吳 婷,史兆春

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,江蘇南京,210029)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是一種以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙為特征的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。研究發(fā)現(xiàn),AD腦海馬新生神經(jīng)元的存活率顯著降低,新生神經(jīng)元的突起生長(zhǎng)異常[1-2]。這表明,AD腦的神經(jīng)再生過(guò)程受到嚴(yán)重?fù)p害,提示神經(jīng)再生障礙可能是AD認(rèn)知功能進(jìn)行性減退的重要病理機(jī)制之一[3]。關(guān)于有氧訓(xùn)練引起AD大鼠認(rèn)知功能改善進(jìn)而影響海馬細(xì)胞存活的情況,國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。為此,本研究通過(guò)觀(guān)察運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和海馬細(xì)胞存活的改變,初步探討AD后有氧訓(xùn)練對(duì)海馬神經(jīng)元功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級(jí)健康雄性SD大鼠(24月齡)24只,體重450±20 g,由中國(guó)人民解放軍軍事科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào):SCXK-(軍)-2008-004)。Aβ25-35、DAB 和 Triton X-100購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;Hoechst 33342購(gòu)自美國(guó)Vector Laboratories。其他試劑均為分析純,購(gòu)自南京化學(xué)試劑公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組:迷宮篩選非先天愚型SD大鼠24只。隨機(jī)分為假手術(shù)組(側(cè)腦室注射生理鹽水,n=8)、實(shí)驗(yàn)組(側(cè)腦室注射Aβ25-35,n=8)、有氧訓(xùn)練組(側(cè)腦室注射Aβ25-35+四周有氧訓(xùn)練,n=8)。

1.2.2 老年癡呆大鼠模型制備:大鼠10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)腹腔注射進(jìn)行麻醉,麻醉成功后將大鼠固定在立體定位儀(STOELTING)上,門(mén)齒固定插設(shè)在正中處,頭正中部去毛后皮膚消毒,頭頂正中切口,逐層切開(kāi)皮膚、肌肉,于腦矢狀縫中部開(kāi)口暴露顱蓋骨,參照Paxinos和Watson大鼠腦立體定位圖譜,于前囟后1.0 mm,向右旁開(kāi)1.5 mm,硬腦膜下3.0 mm向雙側(cè)側(cè)腦室區(qū)緩慢注入 5 μ L(2 μ g/μ L,用無(wú)菌生理鹽水溶解Aβ25-35肽段完之后分裝,-20℃保存,用的時(shí)候取出一管37℃孵育7天),每側(cè)注射時(shí)間5 min,留針2 min,緩慢退針。所有操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行,皮膚切開(kāi)處用青霉素抗菌,縫合傷口。

1.2.3 有氧訓(xùn)練:Aβ25-35注射后第三天(此時(shí)Aβ的毒性最強(qiáng))行有氧訓(xùn)練,采用無(wú)負(fù)重游泳,從實(shí)驗(yàn)日起進(jìn)行游泳訓(xùn)練,每次運(yùn)動(dòng)時(shí)間從最初的10 min/日,每天遞增10 min,直至達(dá)到60 min/日,并持續(xù)此量,共訓(xùn)練四周。水溫30±1℃,游泳訓(xùn)練池為180 cm×60 cm×80 cm,內(nèi)壁光滑。

根據(jù)嚙齒類(lèi)動(dòng)物的生活習(xí)慣,所有運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練在晚上6點(diǎn)之后進(jìn)行。

1.2.4 行為學(xué)測(cè)試:有氧訓(xùn)練結(jié)束后各組大鼠行Morris水迷宮(上海吉量軟件科技有限公司)檢測(cè)。Morris水迷宮為一圓形水池,直徑200 cm,高50 cm,水深30 cm,水溫控制在22～24℃。池壁表明四個(gè)入水點(diǎn),由此將水池分為4個(gè)象限,任選某一象限(本實(shí)驗(yàn)選擇第四象限),正中放置一個(gè)直徑11 cm、高29 cm的平臺(tái)。每天約同一時(shí)間(每晚七點(diǎn))將大鼠按四個(gè)象限入水點(diǎn)依次放入水池中,記錄90 s內(nèi)大鼠從入水到找到平臺(tái)所用的時(shí)間,即逃避潛伏期(Escape Latency)。如90 s內(nèi)未能找到,引導(dǎo)其上平臺(tái)并停留10 s,本次成績(jī)記做90 s。Morris水迷宮測(cè)試一天一次,共訓(xùn)練5 d,實(shí)驗(yàn)第6天撤去平臺(tái),記錄大鼠穿越在原平臺(tái)位置的時(shí)間即空間探索實(shí)驗(yàn)兩個(gè)部分。取4個(gè)象限測(cè)試成績(jī)的平均值為當(dāng)日的學(xué)習(xí)成績(jī)。

1.2.5 Hoechst染色:細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí),染色質(zhì)會(huì)固縮,熒光染料Hoechst 33342能少許進(jìn)入正常細(xì)胞膜,使其染上低藍(lán)色,而凋亡細(xì)胞的膜通透性增強(qiáng),因此進(jìn)入凋亡細(xì)胞中的Hoechst 33342比正常細(xì)胞的多,熒光強(qiáng)度要比正常細(xì)胞中要高,在熒光顯微鏡下觀(guān)察,正常細(xì)胞的細(xì)胞核呈正常的藍(lán)色,而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核會(huì)呈致密濃染,或呈碎塊狀致密濃染,顏色有些發(fā)白。大鼠取腦、多聚甲醛固定方法同前。次日取出固定后的鼠腦,沿大腦縱裂切開(kāi)成左右兩半并修飾腦片,行梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋,做海馬連續(xù)冠狀石蠟切片(片厚4 μ m),每個(gè)動(dòng)物連續(xù)切片計(jì)數(shù)5張取一張,取6張。將石蠟切片放入37℃烘箱過(guò)夜后,脫蠟水化,用PBS漂洗5 min,共洗3次后,吸盡液體。加入0.5 mL Hoechst 33342染色液,染色5 min。用PBS洗兩遍,每次3 min。將切片置于載玻片上,滴一滴抗淬滅封片液,蓋上一潔凈的蓋玻片,盡量避免氣泡。熒光顯微鏡可檢測(cè)到呈藍(lán)色的細(xì)胞核。最大激發(fā)波長(zhǎng)為350 nm,最大發(fā)射波長(zhǎng)為460 nm。Hoechst+細(xì)胞的計(jì)數(shù),按照單盲原則,計(jì)數(shù)前對(duì)所有免疫組化染色的腦片進(jìn)行隨機(jī)編碼。在40×物鏡下,觀(guān)察每張腦片海馬亞顆粒細(xì)胞層(SGZ)及顆粒細(xì)胞層(GCL)內(nèi)的Hoechst+細(xì)胞數(shù),算出每張腦片SGZ和GCL區(qū)Hoechst+細(xì)胞數(shù)的平均值;用software Image J(NIH)測(cè)出每張腦片SGZ的長(zhǎng)度,求得每張腦片SGZ的單位長(zhǎng)度的Hoechst+細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果比較

與假手術(shù)組比較,實(shí)驗(yàn)組的逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)(P<0.05)。有氧訓(xùn)練組與實(shí)驗(yàn)組相比,逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05);有氧訓(xùn)練組與正常對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表1。

表1 各組水迷宮測(cè)試結(jié)果比較( ±s)

表1 各組水迷宮測(cè)試結(jié)果比較( ±s)

注:與假手術(shù)組比較,P<0.05;與實(shí)驗(yàn)組比較,＊P<0.05

組別 n 逃避潛伏期(S)假手術(shù)組 8 18.1±5.9實(shí)驗(yàn)組 8 25.5±18.4有氧訓(xùn)練組 8 15.5±5.3＊

2.2 各組大鼠海馬亞顆粒細(xì)胞層內(nèi)的Hoechst+細(xì)胞數(shù)比較

與假手術(shù)組比較,實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬區(qū)內(nèi)的Hoechst+細(xì)胞呈碎塊狀致密濃染,顏色有些發(fā)白,Hoechst+細(xì)胞數(shù)明顯增多(P<0.05);有氧訓(xùn)練組大鼠亞顆粒細(xì)胞層及顆粒細(xì)胞層內(nèi)的Hoechst+細(xì)胞呈致密濃染,陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比實(shí)驗(yàn)組明顯減少(P<0.05)。假手術(shù)組與有氧訓(xùn)練組大鼠海馬區(qū)內(nèi)的Hoechst+細(xì)胞數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表2、圖1、圖2。

表2 各組大鼠海馬區(qū)的Hoechst+細(xì)胞數(shù)比較( ±s)

表2 各組大鼠海馬區(qū)的Hoechst+細(xì)胞數(shù)比較( ±s)

注:與假手術(shù)組比較,P<0.05;與實(shí)驗(yàn)組比較,＊P<0.05

組別 n 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(個(gè)/高倍視野)假手術(shù)組 8 5±1.7實(shí)驗(yàn)組 8 15±3.9有氧訓(xùn)練組 8 7.4±2.2＊

圖1 各組大鼠海馬腦區(qū)內(nèi)的Hoechst染色比較

圖2 各組大鼠海馬腦區(qū)內(nèi)的Hoechst染色比較

3 討 論

AD是一種以獲得性持續(xù)性記憶減退、認(rèn)知功能障礙以及行為異常為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,Morris水迷宮作為檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶水平的重要工具,可以較好的評(píng)價(jià)認(rèn)知功能。本實(shí)驗(yàn)Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組較假手術(shù)組逃避潛伏期明顯延長(zhǎng),撤離平臺(tái)后在原平臺(tái)象限內(nèi)游泳的時(shí)間占整個(gè)游泳時(shí)間百分比顯著降低,表明實(shí)驗(yàn)組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降。有氧訓(xùn)練組大鼠測(cè)試結(jié)果明顯好于實(shí)驗(yàn)組,而與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明有氧訓(xùn)練可以顯著改善AD大鼠的認(rèn)知功能,對(duì)AD大鼠空間認(rèn)知功能損傷具有保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn),AD腦海馬干細(xì)胞增殖有增加的趨勢(shì),前體細(xì)胞的神經(jīng)元分化比例明顯減少,新生神經(jīng)元的存活率顯著降低,新生神經(jīng)元的突起生長(zhǎng)異常。這些研究證實(shí),AD腦的神經(jīng)再生過(guò)程受到嚴(yán)重?fù)p害,提示神經(jīng)再生障礙可能是AD認(rèn)識(shí)功能進(jìn)行性減退的重要病理機(jī)制之一。

AD基本的神經(jīng)病理學(xué)改變?yōu)?神經(jīng)元外形成大量的老年斑、神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)神經(jīng)原纖維纏結(jié)、區(qū)域性的神經(jīng)元及突觸丟失。目前研究認(rèn)為β淀粉樣蛋白(β-amyloid protein,Aβ)沉積是AD發(fā)病的中心環(huán)節(jié),Aβ的神經(jīng)毒性作用是導(dǎo)致AD發(fā)病的重要病因之一。Aβ是由淀粉樣前體蛋白剪切而來(lái),Aβ25-35是具有Aβ神經(jīng)毒作用的最短片段。側(cè)腦室注射Aβ25-35能引起神經(jīng)元變性、突觸丟失、學(xué)習(xí)記憶能力受損等神經(jīng)系統(tǒng)退化的表現(xiàn),因此,Aβ25-35側(cè)腦室注射建立的AD模型與APP或APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠被廣泛地應(yīng)用于A(yíng)D的研究[4-5]。

大量實(shí)驗(yàn)證據(jù)已表明,高濃度的Aβ寡居體具有神經(jīng)毒性,導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[6]。為本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Aβ(25-35)短片段損害海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的存活。與假手術(shù)組相比,實(shí)驗(yàn)組大鼠Hoechst陽(yáng)性細(xì)胞增多,而經(jīng)過(guò)有氧訓(xùn)練后大鼠海馬各區(qū)域神經(jīng)元細(xì)胞凋亡明顯減少,這表明,Aβ?lián)p害細(xì)胞存活,有氧訓(xùn)練能阻止Aβ?lián)p害細(xì)胞存活。這一結(jié)果對(duì)于探求有氧運(yùn)動(dòng)改善AD認(rèn)知功能障礙的病理生理機(jī)制,具有重要意義,同時(shí)在臨床上也有一定的應(yīng)用價(jià)值[7-8]。但本研究只是初步探討有氧運(yùn)動(dòng)與海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的關(guān)系,至于有氧運(yùn)動(dòng)影響海馬神經(jīng)元的細(xì)胞凋亡的機(jī)制及其相關(guān)的調(diào)控因子還有待于進(jìn)一步的研究。

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