阿魏酸鈉對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)纖維化的防治作用

諶洪俊，蘇 寧 ，陳昱江 ，朱春玲，李 龍

（1.貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550002； 2.貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550004）

腎間質(zhì)纖維化是各種腎臟疾病進(jìn)入終末期的共同病理損害，采取各種措施阻止腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生是臨床防治腎小管間質(zhì)病變、保護(hù)腎功能的重要目標(biāo)之一。肝細(xì)胞生長因子（HGF）能促進(jìn)小管上皮細(xì)胞增殖，同時具有抗凋亡的作用，能夠拮抗小管間質(zhì)纖維化[1]。因此，筆者選用HGF研究新型內(nèi)皮素受體拮抗劑阿魏酸鈉（SF）防治單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）大鼠腎間質(zhì)纖維化的作用環(huán)節(jié)和機制，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 試劑與動物

試劑：一抗分別為兔抗大鼠HGF，小鼠抗大鼠!－平滑肌肌動蛋白（!－SMA）單克隆抗體(中山生物公司)，生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG，生物素標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，鏈酶親和素－過氧化物酶復(fù)合物，封閉用正常山羊血清；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色系統(tǒng)（博士德生物公司），鏈霉素親和素－生物素－辣根過氧化物酶(SABC)試劑盒。

動物及分組：雌性SD大鼠（貴陽醫(yī)學(xué)院動物中心，清潔級），體重180～200 g，適應(yīng)性飼養(yǎng) 1周后，隨機分為 4組，即假手術(shù)組（SHAM組），模型組（UUO組），洛汀新治療組[血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）組]，SF治療組，每組均為12只。

1.2 模型建立與給藥方法

UUO組及兩治療組均予戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔注射以麻醉大鼠。取左側(cè)背部脊柱旁1 cm、肋下1 cm縱形切口，逐層分離，找到并游離輸尿管，結(jié)扎并剪斷輸尿管，逐層縫合，清潔傷口，得UUO動物模型。SHAM組僅行輸尿管游離而不結(jié)扎，其余處理方法相同。SF組和ACEI組于手術(shù)前1 d分別按110 mg/(kg·d)和10 mg/(kg·d)灌胃給藥[2－3]；SHAM組及UUO組以等量清水灌胃。試驗期間大鼠自由進(jìn)食進(jìn)水。第9天斷頭處死大鼠，取術(shù)側(cè)腎組織，置10%甲醛溶液中，用于病理切片和免疫組化染色。

1.3 檢測指標(biāo)及半定量分析方法

腎小管間質(zhì)病理改變：將10%甲醛溶液固定的腎組織常規(guī)石蠟包埋切片，經(jīng)HE及Masson染色后，顯微鏡200倍放大后分別在左上、左下、右上、右下、中間各取2個視野，每張切片共10個視野，依據(jù)間質(zhì)纖維化、小管萎縮、間質(zhì)浸潤、紅細(xì)胞管型、蛋白管型、間質(zhì)水腫、小管擴(kuò)張、小管細(xì)胞空泡變性8項指標(biāo)來觀察腎間質(zhì)病理改變并作腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)評分[4]。

免疫組織化學(xué)方法：采用SABC法。載玻片應(yīng)用APES防脫片處理。石蠟切片常規(guī)脫蠟，新鮮配制3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，復(fù)合消化液37℃消化1 h。正常山羊血清封閉液室溫封閉20 min。分別滴加不同的一抗，37℃孵育1 h。滴加生物素化羊抗小鼠或抗兔 IgG，37℃孵育 30 min。滴加 SABC復(fù)合物，室溫下孵育30 min。最后加入DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，蘇木素襯染，脫水、透明、封片。試驗同時采用磷酸鹽緩沖液（PBS緩沖液）替代一抗的方法作為陰性對照。將染色切片于高倍鏡下(200×)觀察15個不重復(fù)的腎小管間質(zhì)視野，測定陽性染色面積占1個視野面積的百分比做半定量分析，觀察腎臟!－SMA及HGF的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 11.10 for Windows軟件，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析。HGF與各項指標(biāo)之間做Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 SF對腎臟病理的影響

肉眼觀察可見，SHAM組腎臟大小、形態(tài)正常，顏色暗紅；UUO組結(jié)扎側(cè)腎臟腫大，顏色變淺，有囊性感，切開后可見褐色混濁尿液，腎實質(zhì)變薄。光鏡下，SHAM組偶見腎小管上皮細(xì)胞空泡變性，灶狀單核細(xì)胞浸潤；UUO組可見彌漫的腎小管上皮細(xì)胞空泡變性，多數(shù)腎小管擴(kuò)張、萎縮，偶見壞死，腎間質(zhì)有多灶狀單核細(xì)胞浸潤和纖維化，腎小球無明顯病變。SF組及ACEI組上述改變均有所減輕，且腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)明顯下降(P＜0.05)，但仍高于SHAM組的水平。

2.2 SF對腎組織內(nèi)HGF和α-SMA表達(dá)及分布的影響

HGF表達(dá)：SHAM組小管間質(zhì)內(nèi)幾乎無表達(dá)。UUO組陽性表達(dá)主要在腎小管周圍細(xì)胞，尤以髓質(zhì)區(qū)明顯，少量腎小管上皮細(xì)胞胞漿也為陽性表達(dá)（圖1）。

圖1 免疫組化示HGF的表達(dá)(200×)

!－SMA表達(dá)：SHAM組的血管壁平滑肌細(xì)胞呈強陽性，腎小球和腎小管上皮細(xì)胞無明顯著色，腎髓質(zhì)稀疏散在分布呈弱陽性。UUO組表達(dá)部位以腎間質(zhì)為主，主要圍繞在萎縮或擴(kuò)張的腎小管周圍，或可見散在于纖維化的腎間質(zhì)中（圖2）。

圖2 免疫組化示!－SMA的表達(dá)(200×)

半定量分析比較：結(jié)果見表1。UUO組的!－SMA及HGF表達(dá)均較SHAM組明顯上調(diào)(P＜0.01)，SF組和ACEI組!－SMA的表達(dá)均較UUO組明顯減少(P＜0.01)，且兩組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。SF組及 ACEI組 HGF 的表達(dá)高于 UUO 組（P＜0.05），但兩組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。HGF與腎小管間質(zhì)損傷指數(shù) (r=0.917,P ＜0.01)及 ! －SMA(r=0.841，P ＜0.01)均為正相關(guān)關(guān)系。

表1 各組大鼠腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)、!－SMA及HGF的改變

3 討論

正常腎組織!－SMA的表達(dá)僅見于腎臟血管，而腎小球和腎間質(zhì)中無或極少表達(dá),說明正常腎臟幾乎無肌成纖維細(xì)胞（MyoF）。在各種病因（如炎癥、免疫反應(yīng)等）刺激下，表達(dá)!－SMA的MyoF可在腎小球系膜區(qū)、腎小球周圍間質(zhì)、萎縮的小管周圍纖維化區(qū)域及血管周圍增生，參與腎臟纖維化形成[5]。本試驗的結(jié)果也顯示，!－SMA的表達(dá)與腎間質(zhì)纖維化程度呈密切的正相關(guān)關(guān)系，提示預(yù)后不良。本試驗中還觀察到!－SMA主要表達(dá)于腎間質(zhì)細(xì)胞及部分小管上皮細(xì)胞，由此推測病理條件下成纖維細(xì)胞的分化、腎小管上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化均可能參與了腎間質(zhì)中MyoF的形成，這與文獻(xiàn)報道基本一致[6]。

生理條件下，腎臟HGF僅表達(dá)于間質(zhì)來源的細(xì)胞上，包括腎小球系膜細(xì)胞、間質(zhì)成纖維細(xì)胞等，其生物學(xué)作用主要是保持正常腎臟結(jié)構(gòu)和功能，促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞的有絲分裂、形態(tài)發(fā)生，并抑制其凋亡[7－8]。有試驗研究證實，急性腎損傷后，組織及血漿中的HGF濃度反應(yīng)性升高，對于維持和重建腎小管結(jié)構(gòu)和功能的完整性起著重要作用[9]。體外試驗也證明，HGF具有促進(jìn)腎小管細(xì)胞再生、有序化排列形成小管分支和細(xì)胞移動的作用[10]。對UUO小鼠小管間質(zhì)纖維化的研究證實，單獨HGF基因治療7 d及14 d后，其抑制!－SMA表達(dá)率分別為54%和60%，并能抑制纖維連接蛋白（FN）及"型膠原等間質(zhì)的沉積，抑制轉(zhuǎn)化生長因子－#（TGF－#）及其受體的表達(dá)[11]。進(jìn)一步的研究表明，HGF與TGF－#在腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程中存在互逆效應(yīng)，在近曲小管細(xì)胞培養(yǎng)液中，HGF能完全阻止由TGF－#所誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞向MyoF轉(zhuǎn)化[12]。本試驗中，UUO組術(shù)后9 d梗阻側(cè)腎HGF表達(dá)均明顯高于SHAM組，且治療組較模型組表達(dá)增高，并與!－SMA相互間呈正相關(guān)表達(dá)，提示在慢性腎臟疾病的早中階段，HGF在腎臟反應(yīng)性表達(dá)增高可發(fā)揮其重要的保護(hù)及修復(fù)功能，且洛汀新及SF能通過上調(diào)HGF的表達(dá)發(fā)揮抗間質(zhì)纖維化作用。

內(nèi)皮素1（ET－1）不僅為強烈的縮血管肽，而且是一種強炎癥介質(zhì)。腎組織多種細(xì)胞（如腎小球系膜細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等）均能合成及分泌成熟的ET－1，同時表達(dá)其受體，通過自分泌和旁分泌作用發(fā)揮多種病理生理學(xué)效應(yīng)[13]。研究表明，ET－1能夠刺激體外培養(yǎng)的人腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖并上調(diào)其TGF－#的表達(dá)，而選擇性內(nèi)皮素受體拮抗劑能夠特異地阻斷上述效應(yīng)[14－15]。田雪飛等[16]證實ET－1可能參與 UUO大鼠的腎間質(zhì)纖維化過程，而內(nèi)皮素受體拮抗劑波生坦有可能通過抑制TGF－#而拮抗纖維化。SF是中藥阿魏、川芎等的有效成分，是一類新的非肽類內(nèi)皮素受體拮抗劑。有研究證實，SF能減輕糖尿病腎病大鼠TGF－!的表達(dá)及ECM的沉積[2]。本試驗觀察到SF能明顯下調(diào)UUO組大鼠"－SMA的表達(dá)，發(fā)揮抗纖維化效應(yīng)，推測SF可能通過阻斷ET－1與其受體的結(jié)合，進(jìn)而抑制TGF－!表達(dá)，促進(jìn)HGF的表達(dá)，從而改善腎臟的纖維化病變。另外，SF的抗炎作用也可能參與了抗纖維化的進(jìn)程，但具體機理有待于進(jìn)一步深入的實驗及臨床研究。

綜上所述，內(nèi)皮素系統(tǒng)可能參與了腎間質(zhì)纖維化過程；SF對于UUO模型同樣具有使腎小管擴(kuò)張及萎縮減少、腎間質(zhì)內(nèi)單核細(xì)胞的浸潤減少、間質(zhì)纖維化病變減輕的治療作用，且療效與ACEI類藥物相似，并與貝那普利一樣能上調(diào)腎臟保護(hù)性因子HGF，發(fā)揮重要的修復(fù)和再生作用，有著良好的臨床應(yīng)用前景。

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