鴨血小分子肽同步酶解工藝的優(yōu)化

劉成梅，吳 孛，鐘業(yè)俊，劉 偉，楊水兵，尹 曼

(1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué) 生物質(zhì)轉(zhuǎn)化教育部工程研究中心，江西 南昌 330047)

鴨血小分子肽同步酶解工藝的優(yōu)化

劉成梅1,2，吳 孛1，鐘業(yè)俊1,2，劉 偉1，楊水兵1，尹 曼1

(1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué) 生物質(zhì)轉(zhuǎn)化教育部工程研究中心，江西 南昌 330047)

通過響應(yīng)面分析，建立中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶同步酶解血漿蛋白的數(shù)學(xué)模型，方差和可信度分析表明該模型擬合度好(Root MSE=0.488768)。運(yùn)用SAS軟件分析得到最佳工藝參數(shù)為：pH7.1，反應(yīng)溫度50.5℃，酶解時間4.8h；在此條件下酶解所得小分子肽無異味，苦味輕，平均粒徑為798.5nm，比表面為0.82634m2/g，Zeta電位為－8.63mV，吸水性為0.4388g/g，吸油性為8.323mL/g。

鴨血；中性蛋白酶；風(fēng)味蛋白酶；酶解；響應(yīng)面優(yōu)化法

Abstract：Response surface analysis based on a 3-variable, 5-level quadratic orthogonal rotation combination design was employed to investigate the optimal conditions for the bi-enzymatic hydrolysis with Neutrase and Flavourzyme of duck plasma proteins for the production of small peptides. In the optimization, a mathematical model describing the degree of hydrolysis of duck plasma proteins as a function of pH and hydrolysis temperature and time was established. Variance and confidence analyses demonstrated satisfactory fitting degree of the model (Root MSE = 0.488768). The optimal values of pH and hydrolysis temperature and time were determined through data analysis using SAS software to be 7.1, 50.5 ℃ and 4.8 h. The small peptides obtained under such conditions had no unpleasant smell and exhibited a slight taste, 798.5 nm average particle size, 0.82634 m2/g specific surface area, －8.63 mV Zeta potential, 0.4388 g/g water absorption ability and 8.323 mL/g oil adsorption ability.

Key words：duck plasma；Neutrase；Flavourzyme；enzymolysis；response surface methodology

我國的畜禽血液資源非常豐富，但目前加工技術(shù)較為落后，產(chǎn)業(yè)化程度較低，除部分以血粉、血豆腐或飼料原料等初級加工形式利用之外，相當(dāng)一部分以污水的形式排放或丟棄，利用率不到10%，致使大量寶貴營養(yǎng)資源流失，且造成嚴(yán)重的環(huán)境污染[1]。

鴨血中富含大量優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，特別是占血液總蛋白質(zhì)含量60%～70%的血紅蛋白[2]，經(jīng)水解出分離出來的小分子肽，不僅有很好的溶解性、低黏度、抗凝膠形成性，在體內(nèi)不用消化可以直接吸收，還具有一系列重要的功能活性，如阿片樣活性、ACE抑制活性、增強(qiáng)血管舒緩激肽活性、刺激細(xì)菌生長活性、鎮(zhèn)痛活性、抗菌活性及抗氧化活性等[3]。

以畜禽血為原料，深加工開發(fā)小分子肽是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，但技術(shù)路線大多較為單一，純度較低。目前主要技術(shù)有溶劑提取法、酸堿水解法和酶水解法[4-5]。有機(jī)溶劑提取法使用有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，但有機(jī)溶劑的殘留使得產(chǎn)品存在安全隱患；酸堿水解法存在可控性差，產(chǎn)物雜、附加值不高等缺陷；生物酶解一般只需在常壓、中溫條件下進(jìn)行，加上酶解技術(shù)的高效、專一等特性使酶解技術(shù)更具有操作性，是生產(chǎn)小分子肽的一種非常有潛力的技術(shù)[6]，但單一酶的水解度不高、酶解效率低、水解產(chǎn)物較為粗放。姜紅等[7]選用木瓜蛋白酶對天山馬鹿茸血進(jìn)行水解制備免疫活性肽，在52℃、pH7.2、酶用量8U/g、底物濃度為10%時，水解度達(dá)到最大為18.1%。周娟娟等[8]選用堿性蛋白酶對鴨血進(jìn)行單酶水解，在溫度50℃、酶用量8000U/g底物、底物濃度7%、pH值為10，酶水解2h時水解度達(dá)到最大，但仍小于16%。

目前，越來越多的研究集中于將兩個或多個作用條件相近的酶解過程耦合起來，即同步酶解，多種酶同步作用于底物，在增強(qiáng)酶解效果的同時還能減少酶解時間和能耗。本實(shí)驗(yàn)采用同步酶解法水解鴨血血漿蛋白，選擇合適的內(nèi)切和外切蛋白酶，以酶的水解度和苦味肽生成量為指標(biāo)，通過控制酶解時間、酶解溫度、pH值、酶用量等條件，建立血漿蛋白的最佳酶解工藝，提高血漿蛋白的水解度，減少苦味肽生成量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鴨血血漿蛋白 江西煌上煌集團(tuán)有限公司。

氫氧化鈉、鹽酸、甲醛、硫酸、鄰苯二甲酸氫鉀等(均為國產(chǎn)分析純)；中性蛋白酶(最適pH6.5～7.5，最適溫度45～55℃)、風(fēng)味蛋白酶(最適pH5.5～7.5，最適溫度50～55℃) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KDY-9820凱氏定氮儀 廈門精藝興業(yè)公司；VIS-7200紫外可見分光光度儀 北京普析通用公司；ULTERASETTE screen超濾設(shè)備 美國Pall公司；MDRP-50型離心噴霧干燥機(jī) 無錫市現(xiàn)代噴霧干燥設(shè)備有限公司；Potential / Partical Sizer NICOMP 380/ZLS納米粒度分析儀 美國PSS公司；SSA-4200比表面積孔徑測定儀北京彼奧德電子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質(zhì)水解度(DH)的測定[9]

總氮(TN)含量的測定： GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白質(zhì)的測定》[10]。

氨基氮(AN)含量的測定：SB/T 10318—1999《氨基氮測定法》[11]。

1.3.2 吸水性測定[12]

準(zhǔn)確稱取1g 小分子肽，平鋪于直徑為10cm的培養(yǎng)皿(質(zhì)量為m1)中，置于恒溫恒濕(32℃，RH 90%)的培養(yǎng)箱中，每隔6h時測定一次培養(yǎng)皿的質(zhì)量，至培養(yǎng)皿的質(zhì)量不再增加時停止測定，此時培養(yǎng)皿的質(zhì)量為m2，則樣品的吸水性按下式計(jì)算：

1.3.3 吸油性測定[13]

準(zhǔn)確量取0.3g 小分子肽于10mL離心管中，加3mL油，用玻棒攪拌lmin，靜止30min后在2000r/min的條件下離心25min，將未被吸附的油析出，記下游離油的體積(V游離油)，通過總油與未被吸附油的體積之差測定其吸附油的百分率，則吸油性按下式計(jì)算：

1.3.4 粒度和Zeta電位測定

采用NICOMP380/ ZLS納米粒度分析儀測定小分子肽的粒度分布及其Zeta電位。將2g小分子肽溶解于98g水中配制成小分子肽溶液，取3～4mL上機(jī)測定。

1.3.5 比表面積測定

采用低溫氮吸附方法測定小分子肽的比表面積。樣品于烘箱中70～80℃預(yù)處理2h以上，使樣品水分含量降到5%以下，在SSA-4200比表面積孔徑測定儀上進(jìn)行測定，標(biāo)準(zhǔn)樣品為碳黑。

1.3.6 苦味度測定

由5位味覺靈敏的品嘗人員適度品嘗，對小分子肽苦味度評級，然后進(jìn)行綜合評定，苦味度共分5級：重、較重、較輕、輕、無。

2 結(jié)果與分析

2.1 血漿蛋白深度水解條件的響應(yīng)面分析

蛋白質(zhì)的酶水解生產(chǎn)小分子肽是增強(qiáng)蛋白質(zhì)附加值的一種效果方法，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的性質(zhì)由水解程度和產(chǎn)生的肽的結(jié)構(gòu)決定，而水解程度又依賴于蛋白質(zhì)的性質(zhì)和所使用酶的特性，同時與水解條件，尤其是 pH值和溫度有關(guān)。

在本實(shí)驗(yàn)中，若采用單一酶水解血漿蛋白，不僅水解度低，同時因生成苦肽而產(chǎn)生苦味，因此將多種蛋白酶復(fù)合，進(jìn)行深度水解，可斷開血漿蛋白分子肽鏈內(nèi)部的肽鍵，同時分解苦味肽段，降低苦味。在前期研究中發(fā)現(xiàn)中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶復(fù)合水解鴨血血漿蛋白，效果較好，且其最適水解條件相近，因此考慮同步進(jìn)行兩種蛋白酶的酶解，以提高酶解效率，降低能耗。

同步酶解是一個系統(tǒng)化過程，各因素間關(guān)聯(lián)更為細(xì)密，微小的環(huán)境變化(如pH值、溫度、水解時間等)便會對整個酶解系統(tǒng)造成較大影響，因此采用二次回歸正交通用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)(三因素、五水平)安排實(shí)驗(yàn)，探討各因素間相互關(guān)系及其對水解度和苦味生產(chǎn)量的影響[14-15]。3個因素包括X1(pH值)、X2(溫度)、X3(中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶作用時間)，所考察的響應(yīng)值為水解度DH(%)，中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶用量(E/S)分別為0.3%和0.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，各因素水平編碼見表1。

表1 響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素水平編碼表Table1 Variables and levels in the quadratic orthogonal rotation combination design

采用SAS 軟件(V9.0)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，建立數(shù)學(xué)模型，并應(yīng)用脊嶺分析優(yōu)化工藝參數(shù)，應(yīng)用MATLAB 7.0 進(jìn)行直觀作圖分析[16]。

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Quadratic orthogonal rotation combination design and experimental results of degree of hydrolysis of duck plasma proteins

將表2的結(jié)果用SAS軟件進(jìn)行編程計(jì)算，通過其響應(yīng)面回歸(RSREG)程序進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得出回歸模型。

2.2 二次回歸模型擬合及方差分析

運(yùn)用SAS-RSREG程序?qū)?0個試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程：

對方程進(jìn)行方差分析，所得結(jié)果見表3。

表3 方差及可信度分析Table 3 Variance and confidence analyses for the fitted regression model

由表3可見，模型一次項(xiàng)、二次項(xiàng)及總模型的“Prob＞F”均小于0.01，說明一次項(xiàng)、二次項(xiàng)及總模型與響應(yīng)值之間的相關(guān)性極顯著；離回歸偏差只有0.488768，說明方程擬合度好；總模型的決定系數(shù)(R2值)為0.9751，表明理論上該模型可以反映響應(yīng)值的97.51%?？傮w上講，表3的結(jié)果表明該模型的擬合度較好。3個因素對水解度的影響強(qiáng)弱順序依次是X1＞X3＞X2，即pH值＞酶解時間＞溫度。

2.3 響應(yīng)面直觀分析

圖1 pH值與溫度對水解度影響的響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface plot indicating the interactive effects of pH and hydrolysis temperature on degree of hydrolysis of duck plasma proteins

圖2 溫度與時間對水解度影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plot indicating the interactive effects of hydrolysis temperature and time on degree of hydrolysis of duck plasma proteins

圖3 pH值與時間對水解度影響的響應(yīng)面圖Fig.3 Response surface plot indicating the interactive effects of pH and hydrolysis time on degree of hydrolysis of duck plasma proteins

運(yùn)用Matlab軟件對二次回歸模型進(jìn)行規(guī)范分析，作出相應(yīng)曲面圖，結(jié)果如圖1～3所示。從圖中可以直觀地了解各因素對水解度的影響以及各因素之間的交互作用，隨著溫度和pH值的增加，水解度先增大后減小，而隨著酶解時間的增加，水解度一直呈上升趨勢。采用SAS脊嶺分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行尋優(yōu)，結(jié)果表明，X1、X2和 X3理論上分別取7.078200、50.457189和4.810755時可以得到理論最大水解度26.017475%。即最佳酶解工藝參數(shù)為：pH7.1，反應(yīng)溫度50.5℃，酶解時間4.8h。

2.4 最優(yōu)條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

表4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 The result of validation test

以最佳工藝參數(shù)條件做3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表4所示，實(shí)際值與預(yù)測值相差不大，3次實(shí)驗(yàn)的相對誤差均在0.33%以內(nèi)，說明回歸方程能夠真實(shí)的反應(yīng)各因素對水解度的影響。

2.5 小分子血肽理化性質(zhì)測定與分析

將最佳酶解條件所得酶解液進(jìn)行超濾(ULTERASETTE screen超濾系統(tǒng)，超濾膜截留分子量為3000D，操作壓力為28psi，處理時間為40min)、噴霧干燥(離心噴霧干燥機(jī)，進(jìn)風(fēng)溫度為195～200℃，進(jìn)料速度為29.0～30.0mL/min，出風(fēng)溫度為90～95℃)得到淺黃色血肽粉，無異味，苦味度輕；檢測血肽部分理化性質(zhì)，結(jié)果顯示平均粒徑為798.5nm，比表面為0.82634m2/g，Zeta 電位為－8.63mV，吸水性為0.4388 g/g，吸油性為8.323mL/g。

圖4 內(nèi)切蛋白酶和外切肽酶水解蛋白質(zhì)示意圖Fig.4 Flowchart for protein hydrolysis with endoprotease followed by exoprotease

采用蛋白酶水解血漿蛋白，蛋白質(zhì)降解變成小肽和氨基酸后，味道更為鮮美，同時也產(chǎn)生苦味。中性蛋白酶屬內(nèi)切蛋白酶，一般作用于分子肽鏈內(nèi)部的肽鍵，斷開肽鏈，水解至中等程度時，末端為疏水性氨基酸的肽產(chǎn)生苦味，即生成了苦味肽，此時進(jìn)一步用風(fēng)味蛋白酶(包含外切肽酶)水解，可將苦味肽段分解，既脫除水解液的苦味，增進(jìn)和改善了水解液的風(fēng)味，同時增大了蛋白的水解度[17]，如圖4所示。本實(shí)驗(yàn)通過中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶同步酶解鴨血血漿蛋白，產(chǎn)物水解度高，苦味少，同時降低生產(chǎn)能耗，縮短了酶解時間，對其他動物血液酶解制備小分子肽也具有一定借鑒意義。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用二次回歸通用旋轉(zhuǎn)正交設(shè)計(jì)，通過SAS軟件進(jìn)行相應(yīng)面分析，建立了中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶同步酶解工藝中pH值、水解溫度、水解時間對水解度的數(shù)學(xué)模型。通過相關(guān)方差和可信度分析表明，模型擬合度較好。運(yùn)用SAS的脊嶺分析優(yōu)化中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的同步酶解參數(shù)：pH7.1，反應(yīng)溫度50.5℃，酶解時間4.8h。驗(yàn)證結(jié)果表明，預(yù)測值與實(shí)際情況相差不大。經(jīng)理化指標(biāo)測定，小分子血肽成品無異味，苦味輕，平均粒徑為798.5nm，比表面為0.82634m2/g，Zeta電位為－8.63mV，吸水性為0.4388g/g，吸油性為8.323mL/g。

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Optimization of Bi-enzymatic Hydrolysis of Duck Plasma Proteins for Production of Small Peptides

LIU Cheng-mei1,2，WU Bei1，ZHONG Ye-jun1,2，LIU Wei1，YANG Shui-bing1，YIN Man1
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. Engineering Research Center of Biomass Conversion, Ministry of Education, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

TS201.1；TS251.93

A

1002-6630(2010)10-0151-04

2009-12-22

劉成梅(1964—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：chengmeiliu@yahoo.com.cn