超聲波復合酶法提取桑黃多糖研究

謝麗源，王富偉，李洪軍，甘炳成，彭衛(wèi)紅，譚 偉，黃忠乾

(1.西南大學食品科學學院，重慶 400716；2.四川農(nóng)業(yè)科學院土壤肥料研究所，四川 成都 610066；3.四川農(nóng)業(yè)大學資源環(huán)境學院，四川 雅安 625014)

超聲波復合酶法提取桑黃多糖研究

謝麗源1,2，王富偉3，李洪軍1，甘炳成2,*，彭衛(wèi)紅2，譚 偉2，黃忠乾2

(1.西南大學食品科學學院，重慶 400716；2.四川農(nóng)業(yè)科學院土壤肥料研究所，四川 成都 610066；3.四川農(nóng)業(yè)大學資源環(huán)境學院，四川 雅安 625014)

采用單因子分析和正交試驗，以桑黃菌絲體提取物中多糖得率為指標，對超聲波復合酶法中影響多糖提取效果的主要因素進行研究。結果表明：超聲波提取優(yōu)化工藝條件為超聲處理時間20min、料液比1:25(g/mL)、功率500W，在此基礎上提取多糖得率為3.356%，在超聲波優(yōu)化結果基礎上，進一步進行復合酶法處理，酶解最佳提取條件是pH6.5，酶解溫度50℃，纖維素酶添加量2.5%、果膠酶添加量2.5%、蛋白酶添加量1%，酶解時間120min，多糖得率為6.619%，由此可見，超聲波和復合酶法雙重處理提取桑黃多糖是一種有效的提取方法，適合大規(guī)模生產(chǎn)運用。

桑黃；多糖；超聲波；復合酶；正交試驗

Abstract ：To develop an optimal procedure based on ultrasonic pretreatment followed by enzymatic hydrolysis for the extraction of polysaccharides from the fermented mycelia of Phellinus linteus, single factor and orthogonal array design methods were used to deal with the effects of crucial ultrasonic pretreatment and hydrolysis parameters on polysaccharide yield. Results showed that the optimization of ultrasonic pretreatment led to 3.356% polysaccharide yield, in which, the optimal values of ultrasonic power, pretreatment time and material/liquid ratio were determined to be 500 W, 20 min and 1:25 (g/mL), respectively.The optimization of enzymatic hydrolysis leading to 6.619% polysaccharide yield was achieved through the combinatorial use of cellulase at 2.5% dosage, pectinase at 2.5% dosage and neutral proteinase at 1% dosage for the hydrolysis for 120 min at pH 6.5 and 50 ℃. The combination of ultrasonic pretreatment and enzymatic hydrolysis may provide a good idea for the large-scale production of polysaccharides from the fermented mycelia of Phellinus linteus.

Key words：Phellinus linteus；polysaccharide；ultrasonic；compound enzyme；orthogonal test

桑黃是一種珍稀的藥用真菌[1]。醫(yī)學表明，具有抗腫瘤、抗氧化、抗肝纖維化、增強免疫等藥理活性[2-7]，被國際公認為抗腫瘤效果最好的藥用真菌之一。與大多數(shù)藥用真菌一樣，桑黃水提物的主要活性成分是多糖，而多糖是構成真菌細胞壁的主要成分，與纖維素、蛋白質等緊密聯(lián)結，不易分離。常用的熱水提取方法，耗時長，多糖得率低[8]。

近年來，隨著超聲波技術被廣泛的應用于真菌、植物組織中活性物質的提取，不少研究人員也將其運用于真菌多糖的提取[9-10]，但得率仍不夠理想。酶解技術有著反應條件溫和、周期短、成本低等優(yōu)勢被運用到真菌多糖提取中的研究也有報道[11-12]，但是所用的酶大多為纖維素酶。將超聲波復合酶酶解技術運用到桑黃多糖提取的報道比較少見。本研究采用超聲波和復合酶法處理技術對桑黃多糖進行提取，即先進行超聲波處理，再進行復合酶解，并優(yōu)化提取的最佳條件，旨在最大限度提高多糖得率，為桑黃多糖的產(chǎn)業(yè)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

桑黃(Phellinus linteus)菌株10＃，由四川省農(nóng)業(yè)科學院微生物研究中心提供，菌株在50L發(fā)酵罐發(fā)酵，收獲菌體。

98%濃硫酸、95%乙醇、果膠酶(酶活力7×104U/g)成都市科龍化工試劑廠；纖維素酶(酶活力15U/mg) 上海伯奧生物科技有限公司；中性蛋白酶(酶活力6×104U/g)北京奧博星生物技術有限責任公司；苯酚、氯仿、正丁醇均為國產(chǎn)分析醇。

R-201旋轉蒸發(fā)器 上海申勝生物技術有限公司；JY92-ⅡDN超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；PHS-3C pH計 上?？祪x儀器有限公司；GLI66-Ⅱ高速離心機 上海安亭科學儀器廠；紫外分光光度計 日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 提取工藝

將桑黃菌絲體60℃烘干，研磨成粉末狀過60目篩備用。

1.2.2 多糖含量測定

采用苯酚-硫酸比色法[13]。

1.2.3 多糖得率計算

1.2.4 超聲波處理條件優(yōu)化

1.2.4.1 超聲時間對多糖得率的影響

準確稱量1g菌絲體，按料液比1:30(g/mL)加蒸餾水，在功率300W條件下，超聲時間分別按10、15、20、25min處理，測定多糖含量及計算得率。實驗設3個重復。

1.2.4.2 料液比對多糖得率的影響

準確稱量1g菌絲體，在功率300W條件下，處理時間按第一步最佳得率確定，料液比分別按1:20、1:25、1:30、1:35、1:40處理，測定多糖含量及計算得率。

1.2.4.3 超聲功率對多糖得率的影響

準確稱量1g菌絲體，處理時間和料液比分別按1.2.4.1節(jié)和1.2.4.2節(jié)最佳得率處理，功率分別按100、200、300、400、500W處理，測定多糖含量及計算得率。

1.2.4.4 超聲波正交試驗

在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗對影響提取的因素如時間、料液比及功率進行條件優(yōu)化。

1.2.5 復合酶處理條件優(yōu)化

1.2.5.1 酶解時間對多糖得率的影響

纖維素酶、果膠酶、蛋白酶組成的復合酶均在添加量2%、溫度45℃、pH6.5，酶解時間分別按40、60、80、100、120min處理，測定多糖含量及計算得率。

1.2.5.2 pH值對多糖得率的影響

纖維素酶、果膠酶、蛋白酶組成的復合酶均在添加量2%、溫度45℃、1.2.5.1節(jié)確定的最佳酶解時間，pH值分別按4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5處理，測定多糖含量及計算得率。

1.2.5.3 溫度對多糖得率的影響

纖維素酶、果膠酶、蛋白酶組成的復合酶均在添加量2%，1.2.5.1節(jié)和1.2.5.2節(jié)確定的最佳條件，溫度分別按35、40、45、50、55、60℃處理，測定多糖含量及計算得率。

1.2.5.4 復合酶法正交試驗

在超聲波后復合酶解單因素試驗的基礎上，用正交試驗對影響提取的因素：酶解時間、復合酶添加量、pH值及酶解溫度進行條件優(yōu)化。

2 結果與分析

超聲波復合酶法提取多糖全過程為超聲波處理和復合酶酶解兩個階段，這兩個階段都很重要。第一階段是通過超聲波空化效應對原料的破碎作用，使不易被浸出細胞壁的化學成分和溶劑充分接觸；第二階段是在超聲波處理后再通過復合酶解細胞表面結構及胞間連接物，使溶于水的胞內(nèi)多糖浸出率增加。

2.1 超聲波法處理條件優(yōu)化

2.1.1 超聲處理時間對多糖得率的影響

圖1 不同超聲時間對多糖得率的影響Fig.1 Effect of ultrasound treatment time on polysaccharide yield

由圖1可以看出，隨著超聲處理處理時間延長，細胞破碎程度增大，內(nèi)部的多糖物質便開始溶出，多糖得率開始升高，當超聲時間為 20min時達到最大值，隨后開始回落。這是由于隨著超聲處理時間的繼續(xù)延長，空化效應的作用力減小，使得桑黃顆粒表面對提取的物質吸附力增強，多糖得率有所下降。另外，超聲處理時間過長，多糖結構可能被破壞，也是造成多糖含量下降的原因。

2.1.2 料液比對多糖得率的影響

圖2 不同料液比對多糖得率的影響Fig.2 Effect of material/liquid ratio on polysaccharide yield

由圖2所示，在料液比1:25時多糖得率最高，隨著料液比的減小多糖得率降低，這是由于減小料液比減弱了能量的傳遞效果，細胞壁未得到充分的破碎，多糖溶出機率減小所致。

2.1.3 超聲功率對多糖得率的影響

圖3 不同超聲功率對多糖得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on polysaccharide yield

由圖3所示，隨著超聲功率的增大，多糖得率逐漸提高，當功率為300W時達到最大，然后多糖得率開始下降，原因可能是伴隨著功率的增大，產(chǎn)生的沖擊波、剪切力迫使細胞壁破碎，多糖得率增加，但隨著功率的進一步提高，多糖的結構被破壞的可能性也大大增加，導致含量下降。

2.1.4 超聲波法正交試驗

在單因素試驗的基礎上，采用正交表L9(34)對影響提取的因素：超聲時間、料液比及超聲功率進行條件優(yōu)化。因素水平設計見表1。

表1 超聲波法正交試驗因素和水平Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design for the optimization of ultrasonic pretreatment

表2 超聲波法正交試驗結果Table 2 Experimental results of orthogonal array design for the optimization of ultrasonic pretreatment

表3 超聲波法正交試驗方差分析Table 3 Variance analysis for polysaccharide yield with various ultrasonic pretreatment conditions

正交試驗結果見表2。極差R和方差分析表明，影響多糖得率的主次順序是C＞A＞B，B因素各水平達到顯著水平，C達到極顯著水平，最佳水平因素組合是A2B2C3，即超聲時間20min、料液比1:25、超聲功率500W，在此條件得到的多糖得率為3.356%。但實際多糖含量遠高于上述方法得到的多糖含量，為達到更好的提取效果，在此條件優(yōu)化的基礎上，繼續(xù)進行復合酶處理。

2.2 超聲波后復合酶酶解條件優(yōu)化

2.2.1 超聲波后酶解時間對多糖得率的影響

圖4 不同酶處理時間對多糖得率的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis time on polysaccharide yield

從圖4可以看到，隨著酶解時間的增加多糖得率逐漸增大，100min時達到一個最大值，當酶解時間超過100min后，酶解基本完全，隨時間的延長，多糖得率提高緩慢。

2.2.2 超聲波后pH值對多糖得率的影響

從圖5可以看出，隨著pH值的增大多糖得率增大，酶解的最適pH值在6附近，大于6以后多糖提取開始下降，由于酶對pH值比較敏感，pH值的變化可以改變酶空間構象而引起酶活性的降低。

2.2.3 超聲波后酶解溫度對多糖得率的影響

圖6 不同酶解溫度對多糖得率的影響Fig.6 Effect of hydrolysis temperature on polysaccharide yield

從圖6可以看出，復合酶的最適溫度在45℃，多糖得率最高，溫度進一步升高，多糖得率降低。這是因為溫度升高，反應速度加快，多糖得率增加，但是酶本身也是一種蛋白質，溫度過高時因變性而失去活性，導致多糖得率降低。

2.2.4 復合酶法正交試驗

為進一步考察單因素對結果的綜合影響，根據(jù)單因素試驗確定的條件范圍，設計L18(37)正交試驗對影響提取的因素如酶解時間、酶解pH值、酶解溫度及復合酶酶量進行條件優(yōu)化。因素水平設計見表4。

表4 超聲波酶法正交試驗因素和水平Table 4 Factors and levels in the orthogonal array design for the optimization of enzymatic hydrolysis

表5 超聲波酶法正交試驗結果Table 5 Experimental results of orthogonal array design for the optimization of enzymatic hydrolysis

復合酶法正交試驗結果和方差分析見表5和表6。由極差R分析表明，影響多糖得率的主次順序依次是E＞D＞C＞B＞A＞F，酶解溫度、纖維素酶添加量、pH值因素水平差異對多糖得率的影響達到極顯著水平，蛋白酶添加量達到顯著水平，最佳水平因素是A3B1C3D3E3F3，即果膠酶添加量2.5%、蛋白酶添加量1%、纖維素酶添加量2.5%、酶解溫度50℃、pH6.5、酶解時間120min，此條件下多糖得率為6.619%。由此結果可知，超聲波和復合酶雙重處理提取桑黃多糖，得率較僅用超聲波處理(多糖得率3.356%)有很大提高，由此可見，在用超聲波處理后，有進一步用復合酶酶解的必要。

表6 超聲波酶法正交試驗方差分析Table 6 Variance analysis for polysaccharide yield with various enzymatic hydrolysis conditions

3 討 論

由于真菌多糖自身的藥用價值，因此在醫(yī)藥和保健品領域得到越來越多的廣泛應用，提取技術是真菌多糖能否大規(guī)模運用的關鍵。通過單因素試驗和正交試驗，確定超聲波提取桑黃多糖的最佳條件為超聲時間20min、功率500W、料液比1:25，在此條件下多糖得率為3.356%；在超聲波處理基礎上繼續(xù)進行復合酶酶解，其提取最佳條件為果膠酶添加量2.5%、蛋白酶添加量1%、纖維素酶添加量2.5%、酶解溫度50℃、pH6.5、酶解時間120min，在此條件下多糖得率可達到6.619%。由此可見，超聲波復合酶提取多糖得率的兩個階段對多糖得率的影響均非常重要，是值得借鑒的一種桑黃多糖提取方法。這是由于在整個超聲處理過程中，超聲波的空化效應雖然能增加對原料的破碎效果，增加多糖溶出率，但是它不能完全的將細胞壁破碎，而酶的加入彌補這一缺陷，對細胞壁進行進一步的酶解，多糖溶出幾率越大。

超聲波是以一種機械的方法將細胞壁破碎，而酶解雖然溫和，兩者難免都會對溶出的多糖在結構上有一定的破壞，進而影響多糖的結構、生物活性等。因此超聲波法、超聲波復合酶法與熱水浸提法提取的桑黃多糖在多糖組分、生物活性、結構等方面有沒有差異，何種差異尚待進一步研究。

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Ultrasonic Pretreatment Followed by Enzymatic Hydrolysis for Extraction of Polysaccharides from Fermented Mycelia of Phellinus linteus

XIE Li-yuan1,2，WANG Fu-wei3，LI Hong-jun1，GAN Bing-cheng2,*，PENG Wei-hong2，TAN Wei2，HUANG Zhong-qian2
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400716, China；2. Institute of Soil and Fertilizer, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu 610066, China；3. College of Resources and Environment, Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014, China)

R284.2

A

1002-6630(2010)10-0081-05

2009-07-27

四川省青年基金項目(2008ZQ026-072)；四川省科技支撐計劃項目(2008FZ0157)；四川省財政育種工程四川省農(nóng)科院青年基金項目(2007QNJJ-015)

謝麗源(1977—)，女，助理研究員，博士研究生；研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工。E-mail：xieliyuan77@163.com

*通信作者：甘炳成(1968—)，男，研究員，碩士，研究方向為微生物及農(nóng)產(chǎn)品加工。E-mail：bgan918@163.com