超高壓處理對(duì)香蕉果肉多酚氧化酶和過氧化物酶活性抑制的研究

袁根良，楊公明*，余 銘，杜 冰，張雪映，夏 雨，江東文

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642)

超高壓處理對(duì)香蕉果肉多酚氧化酶和過氧化物酶活性抑制的研究

袁根良，楊公明*，余 銘，杜 冰，張雪映，夏 雨，江東文

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642)

為優(yōu)化超高壓處理對(duì)香蕉果肉多酚氧化酶(PPO)和過氧化物酶(POD)的酶活殘存率，首先研究壓力、溫度和保壓時(shí)間對(duì)香蕉果肉PPO和POD的酶活殘存率的影響，然后采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，超高壓處理香蕉果肉PPO和POD的酶活殘存率影響因素的主次順序分別為壓力＞溫度＞保壓時(shí)間和溫度＞壓力＞保壓時(shí)間；超高壓處理香蕉果肉PPO和POD的酶活殘存率最佳工藝參數(shù)為壓力480MPa、溫度55℃、保壓時(shí)間10min，在此條件下，PPO和POD的酶活殘存率分別為0.90%和3.26%。

超高壓；香蕉果肉；多酚氧化酶；過氧化物酶

Abstract：In order to minimize residual polyphenol oxidase (PPO) and peroxidase (POD) activities in banana pulp after ultrahigh pressure treatment, the effects of pressure, temperature and pressure holding time on PPO and POD inactivation in banana pulp were dealt with using single factor and quadratic orthogonal rotation combination design methods. Results showed that the above factors decreasingly affected residual PPO and POD activities in the following order: pressure＞temperature＞pressure hold time and temperature＞pressure＞pressure hold time, respectively. The optimal values of the above factors leading to 0.90% residual PPO activity and 3.26% residual POD activity were identical, 480 MPa held for 10 min and 55 ℃.

Key words：ultra-high pressure；banana pulp；polyphenol oxidase；peroxidase

香蕉是我國熱帶、亞熱帶水果，具有產(chǎn)量高、效益好、可四季收獲的特點(diǎn)，是適種區(qū)農(nóng)民首選的致富作物。我國香蕉栽培水平世界領(lǐng)先，總產(chǎn)量居世界第三位，2007年我國香蕉總產(chǎn)量為779.7萬噸，廣東省香蕉總產(chǎn)量為351.2萬噸，占全國總產(chǎn)量的45%。香蕉含有豐富的營養(yǎng)、功能成分，具有潤腸通便、平衡血鉀、減低血壓、緩解憂郁癥、促進(jìn)心血管健康等功能。香蕉加工過程中，褐變一直是制約香蕉加工業(yè)發(fā)展的一個(gè)重要因素[1]，香蕉加工過程中的褐變主要是由多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)和過氧化物酶(peroxidase，POD)引起的酶促褐變[2-3]。

超高壓加工技術(shù)(ultra high pressure，UHP)屬于一種冷加工技術(shù)，被認(rèn)為是一種很有前景的綠色加工技術(shù)，甚至有人認(rèn)為UHP是21世紀(jì)食品加工“七大技術(shù)之一”。它不僅可以有效殺滅食品中的微生物和鈍化各種食品品質(zhì)酶，而且能保持食物中天然色、香、味和營養(yǎng)成分[4-5]，近年來研究與應(yīng)用日益廣泛。但對(duì)于酶的作用，許多研究認(rèn)為UHP對(duì)果蔬中PPO和POD活性鈍化效果比較離散。Weemaes等[6]發(fā)現(xiàn)鱷梨中PPO活性在800MPa以上時(shí)大部分受到抑制；Seyderhelm等[7]發(fā)現(xiàn)超高壓處理橘子汁時(shí)，室溫條件下POD在400MPa(15min)時(shí)活性才減小，在32℃時(shí)發(fā)現(xiàn)最高失活率為50%，在32～60℃高壓處理后，相反增加了橘子汁中POD的活力；草莓凈化過程中，在300MPa壓力條件下，20℃、15min時(shí)POD的活性才被逐漸滅活，超過300MPa POD的活性有輕微的增加[8]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)超高壓處理香蕉果肉中PPO和POD活性的影響進(jìn)行研究，旨在獲得抑制香蕉果肉PPO和POD活性的最佳條件，為抑制香蕉褐變及加工找到新的技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大蕉 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)三角市場(chǎng)。

鄰苯二酚、愈創(chuàng)木酚、雙氧水、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UHP900MPa-2×2(Ⅱ)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院中低溫實(shí)驗(yàn)室與中國兵器科學(xué)研究院工程師共同研制；TDL-5-A型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；752N紫外可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；DS-1高速組織搗碎機(jī) 上海標(biāo)本模型廠。

1.3 方法

1.3.1 香蕉果肉的制備流程

1.3.2 香蕉果肉PPO、POD酶液的提取和活力測(cè)定

1.3.2.1 PPO酶液的提取

參照Yu等[9]方法，略有修改。稱取超高壓處理過的香蕉果肉2.5g，加入10mL 0.05mol/L pH6.8的磷酸緩沖液(PBS)于冰浴下研磨成勻漿，勻漿液在4℃、4000r/min離心15min，取上清液，記錄酶液總體積。

1.3.2.2 PPO酶活力的測(cè)定

依次向試管中迅速加入0.05mol/L pH6.8 PBS 2.0mL、0.2mol/L鄰苯二酚1.0mL，再加入酶液0.1mL，在398nm波長處進(jìn)行比色測(cè)定，酶液加入后開始記時(shí)，每分鐘記錄一次吸光度(A)，對(duì)照不加酶液，每個(gè)試樣重復(fù)測(cè)3次。酶活力以每分鐘吸光度增加0.001為一個(gè)活力單位。

1.3.2.3 POD酶液的提取

參照高俊鳳等[10]和詹嘉紅[11]的方法。取2.5g香蕉置入玻璃勻漿杯中，加入預(yù)冷的20mL 0.2mol/L pH6.0 PBS進(jìn)行冰浴研磨提取，勻漿液在4℃、4000r/min離心15min，取上清液，記錄酶液總體積。

1.3.2.4 POD酶活力的測(cè)定

反應(yīng)體系中包含反應(yīng)液(0.1mol/L pH6.0 PBS 50mL，愈創(chuàng)木酚28μL，30% H2O219μL)3mL、1mL酶液，在470nm波長處進(jìn)行比色并立即開始計(jì)時(shí)，每分鐘記錄一次A值，共測(cè)5min，每個(gè)試樣重復(fù)測(cè)3次。酶活力以每分鐘吸光度增加0.001為一個(gè)活力單位。

1.3.2.5 香蕉果肉PPO和POD的酶活力計(jì)算

式中：E為酶活力/U；V為酶液總體積/mL；V1為用于測(cè)量酶液體積/mL；m為香蕉質(zhì)量/g。

1.3.2.6 PPO和POD的酶活殘存率的計(jì)算

1.4 單因素試驗(yàn)

1.4.1 不同壓力對(duì)香蕉果肉處理的PPO、POD活性的影響

在常溫、保壓時(shí)間10min，于100、200、300、400、500、600MPa 六種壓力條件下進(jìn)行處理，測(cè)其酶活殘存率。

1.4.2 不同溫度對(duì)香蕉果肉處理的PPO、POD活性的影響

在壓力400MPa、保壓時(shí)間10min，于20、30、40、50、60℃五種溫度條件下進(jìn)行處理，測(cè)其酶活殘存率。

1.4.3 不同保壓時(shí)間對(duì)香蕉果肉處理的PPO、POD活性的影響

在壓力400MPa、常溫，于5、10、15、20、25min五種保壓時(shí)間條件下進(jìn)行處理，測(cè)其酶活殘存率。

1.5 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用三因素二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究壓力、溫度、保壓時(shí)間3因素對(duì)香蕉果肉PPO和POD的酶活殘存率的影響，因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 因素水平編碼表Table 1 Variables and levels in quadratic orthogonal rotation combination design

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SAS 8.1對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析[12-14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 壓力對(duì)香蕉果肉PPO和POD的酶活殘存率的影響

圖1 壓力對(duì)香蕉果肉PPO和POD的酶活殘存率的影響Fig.1 Effect of pressure on residual PPO and POD activities in banana pulp after ultra-high pressure treatment

由圖1可知，在常溫、保壓時(shí)間10min的條件下，PPO和POD的酶活殘存率隨著壓力的增大總體上呈下降趨勢(shì)，但壓力達(dá)到500MPa時(shí)，香蕉果肉POD酶活殘存率反而增加，總體看來，POD的耐壓性比PPO要強(qiáng)。但材料來源不同，其結(jié)果會(huì)表現(xiàn)出一定的差異。Arroyo等[5]研究了超高壓處理對(duì)洋蔥中POD的影響，發(fā)現(xiàn)在300～350MPa壓力條件下處理30min會(huì)使其活性上升，在400MPa壓力時(shí)活性下降不顯著。

2.1.2 溫度對(duì)香蕉果肉PPO和POD的酶活殘存率的影響

圖2 溫度對(duì)香蕉果肉PPO和POD的酶活殘存率的影響Fig.2 Effect of temperature on residual PPO and POD activities in banana pulp after ultra-high pressure treatment

在超高壓處理過程中，介質(zhì)溫度的變化對(duì)酶活的影響往往非常顯著，一般在中溫(50～70℃)條件下與高壓有明顯的協(xié)同作用[16-17]。由圖2可知，在400MPa壓力、保壓時(shí)間10min的條件下，香蕉果肉的PPO和POD的酶活殘存率與溫度呈負(fù)相關(guān)，溫度越高，PPO和POD的酶活殘存率越低。對(duì)山藥處理得到相似結(jié)果亦有報(bào)道，在25～35℃條件下，PPO活性較高，隨著溫度的上升山藥中PPO活性明顯下降[18]。在UHP和溫度聯(lián)合處理胡蘿卜時(shí)，胡蘿卜POD在600MPa、45℃幾乎完全鈍化。在75℃時(shí)處理10min后出現(xiàn)完全的熱失活[19]。

2.1.3 保壓時(shí)間對(duì)香蕉果肉PPO和POD的酶活殘存率的影響

圖3 保壓時(shí)間對(duì)香蕉果肉PPO和POD的酶活殘存率的影響Fig.3 Effect of pressure holding time on residual PPO and POD activities in banana pulp after ultra-high pressure treatment

隨保壓時(shí)間的增加，大多數(shù)酶的酶活逐漸下降，但超過一定時(shí)間后影響不顯著，一般情況下，加壓15min左右酶即可達(dá)到最大失活[7]。由圖3可知，在壓力400MPa、溫度為室溫的條件下，保壓時(shí)間對(duì)香蕉果肉PPO和POD的酶活殘存率規(guī)律不明顯，當(dāng)保壓時(shí)間20min，PPO和POD的酶活殘存率最低；當(dāng)延長保壓時(shí)間到25min時(shí)，PPO和POD的酶活殘存率又同時(shí)上升。

2.2 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Quadratic orthogonal rotation combination design matrix and experimental values of residual PPO and POD activities in banana pulp after ultra-high pressure treatment

利用二次正交旋轉(zhuǎn)回歸設(shè)計(jì)組合設(shè)計(jì)方案，建立香蕉果肉PPO和POD的酶活殘存率的回歸方程，其試驗(yàn)組合及結(jié)果見表2。

表3 多酚氧化酶(PPO)抑制試驗(yàn)的回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis for residual PPO activity in banana pulp after ultra-high pressure treatment with various treatment conditions

表4 過氧化物酶(POD)抑制試驗(yàn)的回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis for residual POD activity in banana pulp after ultra-high pressure treatment with various treatment conditions

對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行逐步回歸分析，得到PPO酶活殘存率(Y1)和POD酶活殘存率(Y2)對(duì)壓力(X1)、溫度(X2)、保壓時(shí)間(X3)的二次多項(xiàng)回歸方程為：

對(duì)該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3、4。從方差分析結(jié)果來看，方程(1)整體模型的Prob＞F＝0.0001遠(yuǎn)小于0.01，方程(2)整體模型的Prob＞F＝0.000515遠(yuǎn)小于0.01，表明二次方程(1)、(2)高度顯著，模型的R2分別為89.40%、84.67%，說明這兩個(gè)模型能很好地解釋此響應(yīng)面。模型(1)中X1、X2和X1X3極顯著，X3和X22顯著，其他不顯著。模型(2)中X1、X2極顯著，X12、X32等交互相也極顯著，X1X3顯著，其他不顯著。

對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，剔除不顯著交互作用，得到Y(jié)1和Y2對(duì)X1、X2、X3的標(biāo)準(zhǔn)回歸方程：

在試驗(yàn)范圍內(nèi)，對(duì)于超高壓處理對(duì)香蕉果肉PPO的酶活殘存率，一次項(xiàng)的偏回歸方程系數(shù)的絕對(duì)值X1＞X2＞X3，說明壓力對(duì)PPO的酶活殘存率影響最大，其次是溫度，最小是保壓時(shí)間；超高壓處理對(duì)香蕉果肉POD的酶活殘存率來說，一次項(xiàng)的偏回歸方程系數(shù)的絕對(duì)值X2＞X1＞X3，說明溫度對(duì)過氧化物酶殘存率影響最大，其次是壓力，最小是保壓時(shí)間。

2.3 工藝參數(shù)優(yōu)化結(jié)果

通過SAS 8.1軟件的優(yōu)化功能及數(shù)學(xué)求偏導(dǎo)，可得PPO和POD的酶活殘存率最小響應(yīng)值所對(duì)應(yīng)的因素條件，PPO和POD的酶活殘存率達(dá)到最低因素條件并不完全一致，得到當(dāng)壓力484MPa、溫度56.8℃和保壓時(shí)間6.59min時(shí)，PPO的酶活殘存率最低為0.83%；當(dāng)壓力484MPa、溫度56.8℃和保壓時(shí)間10.8min時(shí)，POD的酶活殘留率最低為3.22%，這說明兩響應(yīng)值之間相互制約?？紤]到成本問題及各因素對(duì)響應(yīng)值的影響順序，選擇最優(yōu)處理?xiàng)l件為壓力480MPa、溫度55℃和保壓時(shí)間10min，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，香蕉果肉的PPO和POD的酶活殘存率分別為0.90%和3.26%，與理論預(yù)測(cè)值相近。

3 結(jié) 論

3.1 各因素對(duì)抑制香蕉果肉PPO的酶活殘存率的影響順序?yàn)閴毫Γ緶囟龋颈簳r(shí)間，對(duì)抑制香蕉果肉POD的酶活殘存率的影響順序?yàn)闇囟龋緣毫Γ颈簳r(shí)間。

3.2 利用響應(yīng)面分析優(yōu)化超高壓處理對(duì)香蕉果肉PPO和POD的酶活殘存率得到的工藝條件為壓力480MPa、溫度55℃和保壓時(shí)間10min。該條件下香蕉果肉的PPO和POD的酶活殘存率分別為0.90%和3.26%，與理論預(yù)測(cè)值相近，說明利用本實(shí)驗(yàn)建立的模型的優(yōu)化結(jié)果與實(shí)際情況吻合。

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Inhibitory Effect of Ultra-high Pressure Treatment on Polyphenol Oxidase and Peroxidase Activities in Banana Pulp

YUAN Gen-liang，YANG Gong-ming*，YU Ming，DU Bing，ZHANG Xue-ying，XIA Yu，JIANG Dong-wen
(College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

TS205.9

A

1002-6630(2010)10-0064-05

2009-08-31

粵港關(guān)鍵領(lǐng)域重點(diǎn)突破項(xiàng)目(2008A024200004)

袁根良(1984—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称犯咝录夹g(shù)與設(shè)備。E-mail：yuangenliang405@163.com

*通信作者：楊公明(1950—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称芳庸ば录夹g(shù)。E-mail：ygm@scau.edu.cn