杜仲素抗氧化活性研究

彭密軍，彭 勝，吳吉林，蘭文菊

(吉首大學(xué)林產(chǎn)化工工程湖南省重點實驗室，湖南 張家界 427000)

杜仲素抗氧化活性研究

彭密軍，彭 勝，吳吉林，蘭文菊

(吉首大學(xué)林產(chǎn)化工工程湖南省重點實驗室，湖南 張家界 427000)

以VC為陽性對照，對杜仲素和高純綠原酸清除羥自由基(·OH)、超氧陰離子自由基(O2·)及1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基(DPPH自由基)活性進行研究，并通過計算清除率比較清除各種自由基活性的效果。結(jié)果表明：杜仲素在不同自由基體系中抗氧化活性不同，清除自由基能力為O2·＞DPPH自由基>·OH，對3種自由基的最大清除率依次為95.85%、75.31%和31.10%。因此，杜仲素具有較強的抗氧化作用。

杜仲素；綠原酸；VC；自由基；抗氧化活性

Abstract ：To provide theoretical evidences for developing novel natural antioxidants, eucommin and high-purity chlorogenic acid were assessed for their antioxidant effects by hydroxyl, superoxide anion and DPPH free radical assays with vitamin C as a positive control. Curves of free radical scavenging ratio versus concentration were plotted for each of these three compounds.As a result, eucommin had different scavenging effects against different radicals and the best ability to scavenge superoxide anion radicals, followed by DPPH and hydroxyl radicals, with corresponding maximum scavenging ratios of 95.85%, 75.31% and 31.10%. Therefore, eucommin is a potential strong antioxidant.

Key words：eucommin；chlorogenic acid；vitamin C；free radical；antioxidant activity

杜仲(Eucommia ulmoides Oliv)為被子植物門杜仲科杜仲屬單種植物，有“活化石”之稱。杜仲是我國特有的經(jīng)濟樹種和名貴中藥，早在漢代《神農(nóng)本草經(jīng)》中就被列為上品，它具有補中益氣、堅筋骨、強志、安胎等作用[1]。抗氧化成分如環(huán)烯醚萜類化合物、黃酮類化合物、多糖等是杜仲葉的主要活性物質(zhì)[2-3]，這些成分通過清除機體內(nèi)自由基、還原氧化物質(zhì)等，從而達到降脂減肥、抗氧化、抗病毒、保護機體的作用[4]。杜仲素作為杜仲葉提取濃縮液過柱后剩余物(經(jīng)檢測綠原酸和黃酮含量分別為7.44%和27.81%)，一般被用作低附加值的飼料添加劑或低品位產(chǎn)品。為綜合利用這一天然資源，本實驗研究杜仲素的體外清除自由基作用，并與高純綠原酸進行比較分析，以期為杜仲素的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杜仲素 張家界恒興生物科技有限公司；綠原酸中國藥品生物制品檢定所；1,1-二苯基-2-苦苯肼(DPPH)日本W(wǎng)ako公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鹽酸、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、過氧化氫、無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純；所有用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

UV757CRT型紫外可見分光光度計 中國上海精密科學(xué)儀器有限公司；BM400型數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋、WQ-500型超純水裝置 日本Yamato公司；KQ-250E型超聲波清洗器 中國昆山超聲儀器有限公司；AEG-220型電子天平 日本Shimadzu公司。

1.3 方法

1.3.1 杜仲素中綠原酸含量的測定

精確稱取綠原酸對照品0.0172g，用60%乙醇溶解稀釋成27.52μg/mL的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。用此溶液配制一系列梯度溶液于紫外-可見分光光度計波長325nm測定吸光度，繪制曲線方程：y=0.0490x－0.0088，R2= 0.9997。式中：x為溶液中綠原酸質(zhì)量濃度(μg/mL)；y為吸光度。

稱取杜仲素0.1130g杜仲素，用60%乙醇溶解并定容至25mL，過濾，濾液稀釋后于325nm波長處測定吸光度，代入綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得杜仲素中綠原酸含量。

1.3.2 羥自由基(·OH)清除作用測定

采用鄰二氮菲-Fe2+-H2O2法[5-6]，如表1所示依次加入試劑后，用蒸餾水定容至10mL，充分混勻，37℃水浴反應(yīng)1h，冷卻(3個平行)，以空白參比為對照510nm波長處測定吸光度，計算清除率：

式中：A0為空白參比的吸光度；A1為未損傷管的吸光度；A2為損傷管的吸光度；A3為樣品參比的吸光度；A4為樣品管的吸光度。

表1 鄰二氮菲-Fe2+-H2O2體系加樣表Table 1 Protocol of phenanthroline--Fe2+-H2O2reaction system

1.3.3 超氧陰離子自由基(O2·)清除作用測定

采用鄰苯三酚自氧化法[7]產(chǎn)生O2·，參照表2進行加樣，各管在補超純水后均在25℃水浴保溫20min，再加入鄰苯三酚，迅速于紫外分光光度計上420nm波長處測定吸光度，每30s取值一次，連續(xù)取值3min。各管的氧化速率及對O2·的清除率按下列公式計算：

表2 鄰苯三酚自氧化法加樣表Table 2 Protocol of pyrogallol autoxidation

1.3.4 對DPPH自由基的清除作用測定[8-9]

稱取一定量的DPPH自由基，用無水乙醇溶解并定容，配制成0.20mmol/L的溶液。參照表3分別加入試劑和樣品后，于25℃水浴保溫30min，以無水乙醇為參比，紫外分光光度計上514nm波長處測定吸光度，各管對DPPH自由基的清除作用按公式(4)計算：

表3 清除DPPH自由基加樣表Table 3 Protocol of scavenging DPPH·

2 結(jié)果與分析

2.1 杜仲素中綠原酸含量

測定結(jié)果表明，杜仲素中綠原酸的含量為7.44%。

2.2 杜仲素對羥自由基清除作用

圖2 綠原酸對·OH的清除作用Fig.2 Scavenging activity of chlorogenic acid on·OH

圖3 杜仲素清除·OH作用Fig.3 Scavenging activity of eucommin on ·OH

由圖1～3可以看出，VC、綠原酸和杜仲素對·OH均有較強的清除作用。在低質(zhì)量濃度下，清除率與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)；高質(zhì)量濃度促進·OH產(chǎn)生，清除率反而下降。VC質(zhì)量濃度為22μg/mL時，·OH清除率最大為51.44%；綠原酸質(zhì)量濃度為25μg/mL時，·OH清除率最大為38.59%；杜仲素質(zhì)量濃度為52 μg/mL時，·OH清除率最大為31.10%，從以上三者可以看出，VC在較低質(zhì)量濃度下即可達到較好的清除效果，其次為綠原酸，杜仲素效果相對較差。

2.3 杜仲素對超氧陰離子自由基清除作用

圖4 VC對O2·清除作用Fig.4 Scavenging activity of VC on O2·

圖5 綠原酸清除O2·作用Fig.5 Scavenging activity of chlorogenic acid on O2·

圖6 杜仲素對O2·清除作用Fig.6 Scavenging activity of eucommin on O2·

從圖4～6可得知，VC和杜仲素對O2·的清除率隨著質(zhì)量濃度的增大而升高，兩者清除率在216、2115μg/mL時分別達到97.37%、95.85%。而高純綠原酸在1～200μg/mL范圍內(nèi)對O2·幾乎沒有清除作用。由此可見，綠原酸不是杜仲素清除O2·的活性成分。

2.4 杜仲素對DPPH自由基清除作用

由圖7～9可知，VC、綠原酸和杜仲素對DPPH自由基的清除效果隨著活性成分質(zhì)量濃度的增大而增強，質(zhì)量濃度分別為21、29、60μg/mL時清除率達到92.23%、91.25%、75.31%。因此，杜仲素作為一種工業(yè)廢渣，具有較強的生理活性。

圖7 VC清除DPPH自由基作用Fig.7 Scavenging activity of vitamin C on DPPH free radicals

圖9 杜仲素清除DPPH自由基作用Fig.9 Scavenging activity of eucommin on DPPH free radicals

3 結(jié) 論

體外抗氧化實驗結(jié)果表明，綠原酸作為杜仲素中主要活性成分(含量為7.44%)，僅對·OH和DPPH自由基有清除作用，對O2·則無效。而杜仲素具有較好的清除·OH、O2·、DPPH自由基作用，分別在質(zhì)量濃度為52、2115、60μg/mL時3種自由基體系清除率依次為 31.10%、95.85%和75.31%。因此，杜仲素具有較好的抗氧化活性，可以變廢為寶，將其運用于食品、化妝品和醫(yī)藥領(lǐng)域，從而進一步開發(fā)利用杜仲。

[1] 杜紅巖. 杜仲優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)栽培[M]. 北京: 中國林業(yè)出版社, 1996: 1.

[2] 葉文峰. 杜仲葉中化學(xué)成分、藥理活性及應(yīng)用研究進展[J]. 林產(chǎn)化工通報, 2004, 38(5): 40-44.

[3] 晏媛, 郭丹. 杜仲葉的化學(xué)成分及藥理活性研究進展[J]. 中成藥,2003, 25(6): 491-492.

[4] 李健民, 徐艷明, 朱魁元. 杜仲抗氧化生物活性研究進展[J]. 中醫(yī)藥學(xué)報, 2010, 38(2): 137-139.

[5] 蔡仲軍, 陳仕江, 尹定華, 等. 不同產(chǎn)地冬蟲夏草清除羥自由基作用的研究[J]. 中草藥, 2004, 35(1): 57-59.

[6] 梁麗麗, 曹光群, 曾蘭蘭, 等. 中藥地榆提取物對自由基的清除作用[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2008, 20(3): 511-513.

[7] 韓少華, 朱靖博, 王妍妍. 鄰苯三酚自氧化法測定抗氧化活性的方法研究[J]. 中國釀造, 2009(6): 155-157.

[8] KAUR G, ALAM M S, JABBAR Z, et al. Evaluation of antioxidant activity of Cassia siamea flowers[J]. Journal of Ethnopharmacology,2006, 108: 340-348.

[9] 徐懷德, 秦盛華. 超聲波輔助提取光皮木瓜多糖及其體外抗氧化性研究[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(10): 106-111.

Antioxidant Effect of Eucommin

PENG Mi-jun，PENG Sheng，WU Ji-lin，LAN Wen-ju
(Key Laboratory of Hunan Forest Products and Chemical Industry Engineering, Jishou University, Zhangjiajie 427000, China)

R285.5

A

1002-6630(2010)1 9-0084-03

2010-06-30

湖南省教育廳重點項目(08A056)；吉首大學(xué)項目(09JDY024)

彭密軍(1967—)，女，教授，博士，主要從事天然產(chǎn)物研究與開發(fā)。 E-mail：pengmj163@163.com