油菜蜂花粉ACE抑制活性水解物的制備及分離

李天嬌，徐 響,2，孫麗萍,2,*，董 捷,2

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093；2.國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心蜂產(chǎn)品分中心，北京 100093)

油菜蜂花粉ACE抑制活性水解物的制備及分離

李天嬌1，徐 響1,2，孫麗萍1,2,*，董 捷1,2

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093；2.國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心蜂產(chǎn)品分中心，北京 100093)

采用4種蛋白酶水解油菜蜂花粉蛋白制備ACE抑制活性物質(zhì)，高效液相色譜法測(cè)定油菜蜂花粉蛋白水解物對(duì)ACE的抑制率。結(jié)果表明：油菜蜂花粉蛋白酶水解物具有ACE抑制活性，水解物對(duì)ACE的抑制活性差異顯著(P＜0.05)，其中堿性蛋白酶＞中性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞酸性蛋白酶，堿性蛋白酶水解物的IC50為0.35mg/mL。4種蛋白酶水解物經(jīng)Bio P-2凝膠分離后，ACE抑制活性較強(qiáng)的組分主要集中在保留時(shí)間70～120min，在此區(qū)間堿性蛋白酶水解物分離組分對(duì)ACE的抑制率達(dá)到90%以上，分子質(zhì)量在376.4～1355D之間。

油菜蜂花粉蛋白；蛋白酶水解物；ACE抑制活性

Abstract：Four kinds of proteases were used for rape bee pollen protein enzymolysis to prepare ACE inhibitory activity hydrolysates. The ACE inhibitory activity (IC50) of enzymatic hydrolysates was determined by HPLC method. The results indicated that four hydrolysates prepared with different proteases had significantly different ACE inhibitory activities (P＜0.05). The strongest ACE inhibitory activity was observed in alkaline protease derived hydrolysate, with an IC50of 0.35 mg/mL, followed by neutral protease, papain and acid protease derived hydrolysates. Furthermore, four rape bee pollen protein hydrolysates were applied to a Bio P-2 gel column for fractionization. Fractions with a retention time ranging from 70 to 120 min presented stronger ACE inhibitory activity and statistical analysis showed that their ACE inhibition inhibitory ratios were significantly different (P＜0.05). All of the corresponding fractions separated from alkaline protease derived hydrolysate had more than 90%ACE inhibitory ratio, and their molecular weight distribution varied from 376.4 to 1355 D.

Key words：rape bee pollen protein；protease hydrolysates；ACE inhibitory activity

目前，全球高血壓患者已突破10億，我國(guó)高血壓患病人數(shù)近2億，且每年新增高血壓患者在1000萬(wàn)人以上[1]。由于ACEⅠ(血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑)適用于不同程度及年齡的高血壓病人，是常用的降壓藥物，但是會(huì)導(dǎo)致高鉀血癥、可逆性腎損害、咳嗽等副作用和停藥后血壓反跳性升高的藥物依賴作用[2]。來(lái)源于食物的ACE(血管緊張素轉(zhuǎn)化酶)抑制肽安全性高，除了可以克服藥物治療中出現(xiàn)的不良反應(yīng)和依賴作用，還具有眾多的生理活性，如抗氧化、降膽固醇、抗疲勞、促進(jìn)乙醇代謝等活性[3-5]。

蜂花粉是蜜蜂采集植物的精細(xì)胞加上自身腺體分泌物、唾液和蜂蜜混合而形成，蛋白質(zhì)平均含量為20%，富含與降血壓作用相關(guān)的芳香族氨基酸和疏水性氨基酸[6]。本實(shí)驗(yàn)采用蛋白酶水解蜂花粉蛋白質(zhì)，制備具有ACE抑制活性的蛋白酶水解物，為蜂花粉功能食品開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

油菜蜂花粉蛋白 本實(shí)驗(yàn)室自制。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、馬尿酸(hippuric acid)、馬尿酰組氨酰亮氨酸(HHL) Sigma公司；Bio P-2凝膠Bio-Rad公司；堿性蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶 北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

SY-3003B發(fā)酵罐 上海世遠(yuǎn)生物設(shè)備工程有限公司；LP731-8300全自動(dòng)生物層析儀 Bio-Rad公司；GJ-18S立式冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；Seven Easy型pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器有限公司；HZS-H水浴振蕩器 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器公司。

1.2 油菜蜂花粉蛋白酶水解物的制備

油菜蜂花粉蛋白質(zhì)量濃度5g/100mL，4種蛋白酶用量均為1g/100mL，加入鹽酸或氫氧化鈉溶液穩(wěn)定pH值，酸性蛋白酶穩(wěn)定pH4.0，木瓜蛋白酶穩(wěn)定pH6.01，中性蛋白酶穩(wěn)定pH7.04，堿性蛋白酶穩(wěn)定pH9.03，50℃、水解80min，然后經(jīng)沸水浴滅酶，冷卻至室溫，5000r/min離心10min，上清液冷凍干燥，－20℃保藏。

1.3 油菜蜂花粉蛋白酶水解物中蛋白含量的測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法[7]測(cè)定油菜蜂花粉蛋白水解物的蛋白含量。

1.4 油菜蜂花粉蛋白酶水解物對(duì)ACE的抑制作用

HPLC法測(cè)定油菜蜂花粉蛋白酶水解物對(duì)ACE的抑制作用，參照文獻(xiàn)[8]略有修改，20μL HHL(2mg/mL)、20μL水解物、2.5μL 0.1U/mL ACE，37℃反應(yīng)30min，加1mol/L HCl溶液 42.5μL，進(jìn)樣70μL，228nm波長(zhǎng)處檢測(cè)產(chǎn)物馬尿酸(HIP)峰面積，根據(jù)公式(1)計(jì)算抑制率。

式中：IP為蛋白酶水解物對(duì)ACE的抑制率；A1為不加蛋白酶水解物馬尿酸的峰面積；A0為加入蛋白酶水解物后馬尿酸的峰面積。

1.5 油菜蜂花粉蛋白酶水解物的分離

油菜蜂花粉蛋白酶水解物應(yīng)用Bio P-2凝膠(1.5cm×30cm)層析分離，流速0.5mL/min，蛋白酶水解物10mg/mL，上樣量1mL，每10min收集一個(gè)組分，各分離組分冷凍干燥，按1.4節(jié)方法測(cè)定ACE抑制率。

1.6 油菜蜂花粉蛋白酶水解物分子質(zhì)量范圍的測(cè)定

選用VB12(MW1355D)、氧化型谷胱甘肽(MW612.6D)，VB2(MW376.4D)作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按上述層析分離條件進(jìn)行層析，測(cè)定油菜蜂花粉蛋白酶水解物的分子質(zhì)量分布范圍。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜蜂花粉蛋白酶水解物的制備及其對(duì)ACE的抑制作用

表1 油菜蜂花粉蛋白酶水解物蛋白質(zhì)含量和對(duì)ACE的抑制活性Table 1 Protein content and ACE inhibitory activity (IC50) of four rape bee pollen protein hydrolysates prepared with different proteases

IC50即為抑制率達(dá)到50%時(shí)所需的酶水解物質(zhì)量濃度。IC50評(píng)價(jià)水解物對(duì)ACE抑制活性，IC50越小，說(shuō)明ACE抑制活性越大。由表1可知，蜂花粉蛋白經(jīng)過(guò)4種蛋白酶水解，水解物得率均在30%左右。堿性蛋白酶水解物ACE抑制活性最大，IC50為0.35mg/mL。而酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶水解物ACE抑制活性與堿性蛋白酶水解物ACE抑制活性差異顯著(P＜0.05)。堿性蛋白酶水解物的蛋白含量最低，只有56.97%，與其他蛋白酶水解物蛋白含量差異顯著(P＜0.05)。水解物的蛋白含量越低，說(shuō)明水解作用越強(qiáng)，產(chǎn)生的肽越多。

油菜蜂花粉蛋白4種水解物的蛋白含量和ACE抑制活性均有顯著差異(P＜0.05)，這是由于蛋白酶的性質(zhì)造成的，酸性蛋白酶的作用位點(diǎn)為苯丙氨酸、亮氨酸[9]；木瓜蛋白酶的作用位點(diǎn)為精氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸[10]；中性蛋白酶的作用位點(diǎn)為精氨酸、賴氨酸、酪氨酸[11]；堿性蛋白酶的作用位點(diǎn)為丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、酪氨酸[12]。而且油菜蜂花粉中氨基酸含量豐富，其中丙氨酸1.737g/100g、纈氨酸1.289g/100g、亮氨酸1.696g/100g、酪氨酸0.882g/100g、苯丙氨酸1.023g/100g、賴氨酸1.776g/100g、精氨酸1.130g/100g[13]。由于蛋白酶作用位點(diǎn)不同和油菜蜂花粉中氨基酸豐富，不同蛋白酶水解蜂花粉蛋白得到的水解物中蛋白含量和種類不同。堿性蛋白酶水解物的蛋白含量最低，與其他蛋白酶水解物蛋白含量有顯著差異，可能是由于堿性蛋白酶作用位點(diǎn)寬泛，油菜蜂花粉蛋白更容易與堿性蛋白酶作用，生成了更多的活性肽所致。因此，堿性蛋白酶水解蛋白含量最低，ACE抑制活性更強(qiáng)。

Cheung等[14]認(rèn)為ACE抑制肽的活性主要取決于C端氨基酸，C端氨基酸為芳香族氨基酸(酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)時(shí)，其ACE抑制活性較高。另外，N端氨基酸為疏水性氨基酸(纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸)或堿性氨基酸的肽與ACE的親和力較大，ACE抑制活性較強(qiáng)。油菜蜂花粉蛋白堿性蛋白酶水解物可能富含與ACE抑制活性相關(guān)的芳香族氨基酸和疏水性氨基酸。

2.2 油菜蜂花粉蛋白水解物的分離及其對(duì)ACE的抑制作用

油菜蜂花粉蛋白水解物經(jīng)過(guò)Bio P-2凝膠分離，測(cè)定質(zhì)量濃度為0.5mg/mL分離組分的ACE抑制率，結(jié)果見圖1。

圖1 油菜蜂花粉蛋白水解物Bio P-2凝膠層析圖譜及分離組分對(duì)ACE的抑制率Fig.1 Bio P-2 gel filtration chromatographic fractionization of four rape bee pollen protein hydrolysates prepared with different proteases

如圖1所示，ACE抑制活性較強(qiáng)的組分主要集中在70～120min，其對(duì)應(yīng)組分的分子質(zhì)量在376.4～1355D之間。樣品質(zhì)量濃度為0.5mg/mL時(shí)，4種水解物分離組分ACE抑制率存在顯著差異(P＜0.05)，堿性蛋白酶＞中性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞酸性蛋白酶，堿性蛋白酶水解物分離組分ACE抑制率最大，達(dá)到90%以上。酸性蛋白酶水解物80～100min組分ACE抑制率達(dá)到90%，其他組分ACE抑制率在40%左右。木瓜蛋白酶水解物40～70min和70～130min組分，ACE抑制率隨著肽的分子質(zhì)量的減小而上升，ACE最大抑制率為80%。中性蛋白酶水解物組分對(duì)ACE最大抑制率僅為70%。堿性蛋白酶水解物ACE抑制肽主要分布在70～120min，ACE抑制率達(dá)到90%以上。

盡管肽的分子質(zhì)量相同，其氨基酸序列不同，ACE抑制活性也會(huì)不同[15]。Tovar-Perez等[16]研究發(fā)現(xiàn)，堿性蛋白酶作用位點(diǎn)比較寬泛，生成大量C端為酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸的肽，這些C端氨基酸基團(tuán)在競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合ACE活性位點(diǎn)時(shí)起著重要的作用。Matsui等[17]發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)ACE抑制肽在二肽和十肽之間。劉佳[18]以大豆為原料，得到ACE抑制肽為二肽，氨基酸序列為Ser-Trp，IC50為41.1μmol/L。辛志宏等[19]得到小麥ACE抑制肽為三肽，氨基酸序列可能為Ala-Met-Tyr，IC50為5.46μmol/L。Ma等[20]分離蕎麥ACE抑制肽為三肽，氨基酸序列為Gly-Pro-Pro，IC50為6.25μg/mL。本實(shí)驗(yàn)中，堿性蛋白酶水解物ACE抑制肽的分子質(zhì)量在376.4～1355D之間，且具有較強(qiáng)的ACE抑制活性，其氨基酸組成和結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步深入研究。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用蛋白酶水解油菜蜂花粉蛋白，制備出具有ACE抑制活性的蛋白質(zhì)水解物，其中堿性蛋白酶水解物對(duì)ACE的抑制活性最高，IC50值達(dá)到0.35mg/mL，經(jīng)過(guò)Bio P-2凝膠分離，保留時(shí)間在70～120min之間的組分(質(zhì)量濃度0.5mg/mL)對(duì)ACE的平均抑制率高達(dá)90%以上，分子質(zhì)量在376.4～1355D之間。由此可見，從油菜蜂花粉蛋白的堿性蛋白酶水解物中篩選ACE抑制劑，是開發(fā)油菜花粉功能食品的一條新途徑。

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Preparation and Separation of ACE Inhibitory Hydrolysates from Rape Bee Pollen

LI Tian-jiao1，XU Xiang1,2，SUN Li-ping1,2,*，DONG Jie1,2
(1. Bee Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093, China；2. Branch Center of Bee Production, National R&D Center for Agro-Food Processing, Beijing 100093, China)

Q503；S896.4

A

1002-6630(2010)15-0163-04

2010-05-27

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)(nyhyzx07-041)；農(nóng)業(yè)部現(xiàn)代農(nóng)業(yè)蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金(NYCYTX-43)；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目

李天嬌(1984—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)榉洚a(chǎn)品化學(xué)。E-mail：litianjiao2008@yahoo.com.cn

*通信作者：孫麗萍(1963—)，女，研究員，碩士，研究方向?yàn)榉洚a(chǎn)品功能因子的分離與純化。E-mail：caasun@126.com