7S伴大豆球蛋白及其糖基化產(chǎn)物對(duì)大豆11S球蛋白熱聚集的影響

孫煒煒，于淑娟*

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640)

7S伴大豆球蛋白及其糖基化產(chǎn)物對(duì)大豆11S球蛋白熱聚集的影響

孫煒煒，于淑娟*

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640)

研究7S伴大豆球蛋白(β-伴大豆球蛋白)及其糖基化產(chǎn)物對(duì)大豆11S球蛋白熱聚集的影響。從濁度、ξ-電位、粒度、SDS-PAGE測(cè)定得出在30mmol/L Tris-HCl緩沖溶液中(含β-巰基乙醇)，7S球蛋白及其糖基化產(chǎn)物能夠抑制11S球蛋白的熱聚集，并且糖基化產(chǎn)物的抑制效果比未糖基化的7S球蛋白明顯；7S球蛋白及其糖基化產(chǎn)物抑制11S球蛋白熱聚集的機(jī)理不同，7S球蛋白糖基化產(chǎn)物對(duì)11S球蛋白熱聚集的抑制不是由于電荷的作用。

7S伴大豆球蛋白；大豆11S球蛋白；糖基化；熱聚集

Abstract ：The effects of β-conglycinin and glycated β-conglycinin on the thermal aggregation of glycinin was studied. Evidence was presented to suggest that β-conglycinin and glycated β-conglycinin could both prevent thermal aggregation of glycinin in 30 mmol/L Tris-HCl buffer solution (β-Me exsisted). Further, addition of glycatedβ-conglycinin prevented thermal aggregation of glycinin more obviously than β-conglycinin. The results also indicated that the inhibitory mechanism of glycated βconglycinin on glycinin aggregation was not as same as that of β-conglycinin due to charge-charge interactions.

Key words：β-conglycinin；glycinin；glycosylation；thermal aggregation

熱處理是大豆加工過(guò)程中常用的方法之一，大豆蛋白在熱誘導(dǎo)過(guò)程中會(huì)不可避免的產(chǎn)生宏觀聚集體[1]。7S伴大豆球蛋白(β-伴大豆球蛋白)和大豆11S球蛋白是大豆蛋白的主要儲(chǔ)藏蛋白，分別占大豆蛋白總含量的37%和31%[2]。大豆11S球蛋白在有還原劑的溶液中會(huì)產(chǎn)生明顯的熱聚集現(xiàn)象，添加 7S伴大豆球蛋白可以通過(guò)電荷的作用抑制11S球蛋白的熱聚集[3]。

食品中蛋白質(zhì)的糖基化是指通過(guò)蛋白質(zhì)的ε-氨基基團(tuán)與多糖的還原性羰基末端反應(yīng)得到共價(jià)復(fù)合物[4]。糖基化產(chǎn)物對(duì)于環(huán)境條件具有較高的適應(yīng)性，與以次級(jí)力結(jié)合的蛋白質(zhì)-多糖體系相比，其結(jié)合不受熱或pH值的影響[5]。糖基化對(duì)蛋白質(zhì)的表面荷電量、熱穩(wěn)定性、表面疏水性等均有影響，而這些性質(zhì)往往是影響蛋白質(zhì)熱聚集的重要因素[6-7]。由于接入糖鏈的不同，糖基化對(duì)蛋白質(zhì)熱聚集的影響并非完全一樣[8]。對(duì)7S球蛋白抑制11S球蛋白熱聚集的性質(zhì)，許多學(xué)者已經(jīng)做過(guò)研究，但尚未見(jiàn)學(xué)者研究過(guò)糖基化的7S球蛋白對(duì)11S球蛋白熱聚集的影響。

本實(shí)驗(yàn)主要從濁度、ξ-電位、粒度、SDS-PAGE電泳方面研究7S球蛋白及其不同分子質(zhì)量的糖基化產(chǎn)物(G67、G150、G500)在有還原劑存在的Tris-HCl緩沖溶液中對(duì)11S球蛋白熱聚集的抑制作用，為進(jìn)一步開(kāi)展通過(guò)糖基化抑制大豆蛋白熱聚集的研究提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低溫脫脂豆粕(氮可溶性指數(shù)＞80) 山東新嘉華公司；葡聚糖(67、150、500kD) Sigma公司。

所有化學(xué)試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

CR22GⅡ高速冷凍離心機(jī) Hitachi Koki 公司；UV-2300分光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司；ECP3000 SDS-PAGE三恒電泳儀 北京市六一儀器廠；DNP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；NaNo-Zs馬爾文納米粒度分布儀 英國(guó)Marlvern公司。

1.3 方法

1.3.1 7S球蛋白和11S球蛋白的分離純化

7S球蛋白依照Nagano等[9]的方法制備，制備流程如下：

1.3.2 7S球蛋白糖基化產(chǎn)物的制備

將7S蛋白粉與葡聚糖以質(zhì)量比1:1混合后，用水溶解調(diào)至6g/100mL后冷凍干燥。干燥后的粉狀物過(guò)120目篩后放置于干燥器內(nèi)于60℃條件下干熱反應(yīng)，保持相對(duì)濕度79%，并在容器底部放置飽和的KBr溶液，反應(yīng)一周后即得糖基化產(chǎn)物[10]。7S球蛋白與分子質(zhì)量為67、150、500kD的葡聚糖反應(yīng)的糖基化產(chǎn)物分別記為G67、G150、G500。

1.3.3 熱聚集實(shí)驗(yàn)

不同pH值的熱聚集實(shí)驗(yàn)：11S球蛋白分別與等量的7S球蛋白及其糖基化產(chǎn)物(以7S球蛋白計(jì))混合均勻后溶于不同pH值的30mmol/L Tris-HCl緩沖溶液中(含10 mmol/L β-巰基乙醇)于80℃水浴30min[11]，冷卻至室溫測(cè)定濁度和ξ-電位。

不同離子強(qiáng)度的熱聚集實(shí)驗(yàn)：11S球蛋白分別與等量的7S球蛋白及其糖基化產(chǎn)物(以7S球蛋白計(jì))混合均勻后溶于不同離子強(qiáng)度(以NaCl 調(diào)節(jié))Tris-HCl緩沖溶液中(pH8)，于80℃水浴保溫30min，冷卻至室溫測(cè)定濁度和ξ-電位。

1.3.4 濁度測(cè)定

根據(jù)Damodaran等[3]的方法，分別取1.3.3節(jié)熱聚集實(shí)驗(yàn)中的樣品液于波長(zhǎng)540nm處測(cè)定濁度。

1.3.5 ξ-電位測(cè)定

采用馬爾文納米粒度分布儀測(cè)定添加7S球蛋白及其糖基化產(chǎn)物的11S球蛋白溶液熱聚集后的ξ-電位。波長(zhǎng)和散射角度分別固定在632nm和90°，操作溫度為室溫(25℃)。

1.3.6 粒度測(cè)定

采用馬爾文納米粒度分布儀測(cè)定添加7S球蛋白及其糖基化產(chǎn)物的11S球蛋白溶液熱聚集前后的粒徑分布。波長(zhǎng)和散射角度分別固定在632nm和90°，操作溫度為室溫(25℃)。

1.3.7 SDS-PAGE電泳

按照Laemmli[11]的方法在不連續(xù)的緩沖體系中進(jìn)行，使用12%分離膠和4%濃縮膠。樣品以相同比例溶于還原性的緩沖液(10% SDS，2.5%β-巰基乙醇)中，然后在沸水中加熱5min，于6000×g離心3min，以一定比例上樣。電泳過(guò)程恒流，濃縮膠電流40mA，分離膠電流調(diào)至80mA，溴酚藍(lán)前沿至封口膠時(shí)關(guān)閉電源。電泳結(jié)束后將凝膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色40min，使用脫色液(甲醇、冰乙酸、水體積比為1:1:8)脫色至透明，于凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 濁度測(cè)定

圖1 不同pH值緩沖溶液中7S球蛋白及其糖基化產(chǎn)物對(duì)11S球蛋白熱聚集的影響Fig.1 Effects of β -conglycinin and glygatedβ - conglycinin on the thermal aggregation of glycinin under different pH conditions

由圖1可見(jiàn)，在還原劑存在下，11S球蛋白的宏觀聚集主要是由堿性亞基發(fā)生聚集[4]。各組分的濁度都是隨著pH值的增大，先升高后降低，在pH4.8附近濁度最大，偏酸或偏堿均不利于熱聚集。加入7S球蛋白及其糖基化產(chǎn)物后的11S球蛋白溶液的濁度低于11S，且加入7S球蛋白的濁度高于加入其糖基化產(chǎn)物。相比較而言，G500的濁度低于G67和G150(二者濁度曲線相近)。此結(jié)果表明7S球蛋白具有抑制11S球蛋白熱聚集的性質(zhì)，由于大分子糖鏈的接入，導(dǎo)致7S球蛋白空間位阻增大，使得熱聚集程度變得更小，難以形成可溶性的宏觀聚集體，溶液濁度降低。接入到7S球蛋白肽鏈上的葡聚糖分子質(zhì)量越大，空間位阻越大，因此G500比其他兩種糖基化產(chǎn)物的濁度低。這說(shuō)明糖基化有利于增強(qiáng)7S球蛋白對(duì)11S球蛋白熱聚集的抑制作用。

圖2 不同離子強(qiáng)度(NaCl)的緩沖溶液中7S球蛋白及其糖基化產(chǎn)物對(duì)11S球蛋白熱聚集的影響Fig.2 Effects of β -conglycinin and glygatedβ - conglycinin on the thermal aggregation of glycinin under different ionic strength conditions

由圖2可知，11S球蛋白溶液濁度隨著NaCl離子強(qiáng)度的增加而降低，鹽離子濃度的增加有利于抑制11S球蛋白熱聚集[4]，其余組分濁度受離子強(qiáng)度影響不是很大。加入7S球蛋白及其糖基化產(chǎn)物溶液的濁度低于11S球蛋白溶液，并且加入7S球蛋白的濁度高于加入其糖基化產(chǎn)物濁度，3種糖基化產(chǎn)物的濁度曲線相近。此結(jié)果表明，7S球蛋白及其糖基化產(chǎn)物能夠抑制11S球蛋白的熱聚集，但離子強(qiáng)度不是影響其抑制效果的主要因素，糖基化產(chǎn)物的抑制效果比7S球蛋白好，其原因與2.1節(jié)中的原因相似。這同樣說(shuō)明糖基化有利于增強(qiáng)7S球蛋白對(duì)11S球蛋白熱聚集的抑制作用。

2.2 ξ-電位測(cè)定

表1 不同pH值溶液中添加7S球蛋白及其糖基化產(chǎn)物的11S球蛋白溶液加熱后ξ-電位的變化Table 1 Changes in z-potential of glycinin in the presence of βconglycinin or its glycated counter part under different pH conditions after heating at 80 ℃ for 30 min

表2 不同離子強(qiáng)度溶液中添加7S球蛋白及其糖基化產(chǎn)物的11S球蛋白溶液加熱后ξ-電位的變化Table 2 Changes in z-potential of glycinin in the presence of β-conglycinin or its glycated counter part under different ionic strength conditions after heating at 80 ℃ for 30 min

從表1、2可以看出，加入7S球蛋白的11S球蛋白溶液的ξ-電位比未加入7S球蛋白的偏低，7S球蛋白對(duì)11S球蛋白熱聚集的抑制作用主要是由于電荷的作用[3]，7S球蛋白的加入增加了體系中的負(fù)電荷量，ξ-電位的絕對(duì)值越大，說(shuō)明溶液體系越穩(wěn)定[12]。加入7S球蛋白糖基化產(chǎn)物的11S球蛋白溶液的ξ-電位絕對(duì)值始終低于加入11S球蛋白溶液的ξ-電位，然而由2.1節(jié)得出的結(jié)論是加入7S球蛋白糖基化產(chǎn)物的溶液體系比加入7S球蛋白的溶液穩(wěn)定。這說(shuō)明電荷不是決定其體系穩(wěn)定性的主要因素，可能是由于接入長(zhǎng)的糖鏈，使得體系空間位阻增大而抑制了11S球蛋白的熱聚集；中性葡聚糖的接入屏蔽掉了7S球蛋白表面的部分電荷，使得其ξ-電位升高，表面疏水性降低。7S球蛋白糖基化產(chǎn)物抑制11S球蛋白熱聚集的機(jī)理與7S球蛋白的抑制聚集機(jī)理存在一定差異。

2.3 粒度測(cè)定

圖3 添加7S及其糖基化產(chǎn)物的11S溶液加熱后的粒度變化Fig.3 Changes in particle size of soybean glycinin solution in the presence of β-conglycinin or its glycated counter part after heating 30 min

由圖3可見(jiàn)，11S球蛋白溶液加熱后，粒徑明顯增加至1000nm左右，加入7S球蛋白及其糖基化產(chǎn)物的11S球蛋白溶液加熱前的粒徑和未加入的相差不大，但加熱后的粒徑僅增大至60nm左右，并且加入7S球蛋白糖基化產(chǎn)物的粒徑略小于加入7S球蛋白，這說(shuō)明加入7S球蛋白抑制了11S球蛋白的熱聚集，糖鏈的接入進(jìn)一步抑制了體系中宏觀聚集體的生成，這也印證了2.1節(jié)濁度測(cè)定的結(jié)果。

2.4 SDS-PAGE電泳

取pH8、離子強(qiáng)度為0mmol/L(NaCl)的Tris-HCl緩沖溶液溶解大豆球蛋白[13]，各溶液加熱前、后上清液和沉淀的SDS-PAGE圖譜見(jiàn)圖3。

圖4 加熱前、后大豆球蛋白溶液的電泳圖譜Fig.4 SDS-PAGE of soybean glycinin solution before and after thermal treatment at 80 ℃ for 30 min

圖3顯示，11S球蛋白溶液加熱后，上清液中的堿性亞基消失而出現(xiàn)在沉淀的圖譜中，11S球蛋白加熱后產(chǎn)生的宏觀聚集體主要由11S球蛋白的堿性亞基組成[14]。堿性亞基并未出現(xiàn)在加熱后的沉淀中，7S球蛋白抑制了11S球蛋白堿性亞基的聚集，這與資料報(bào)道一致[15]。條帶3、8、13顯示了G67和7S球蛋白一樣能夠抑制11S的熱聚集。同樣，其他條帶顯示了G150和G500對(duì)11S的熱聚集也具有抑制作用。

3 結(jié) 論

7S球蛋白及其糖基化產(chǎn)物都具有抑制11S球蛋白熱聚集的性質(zhì)，并且糖基化產(chǎn)物的抑制效果優(yōu)于未糖基化的7S球蛋白；二者抑制11S球蛋白熱聚集的機(jī)理不同，糖基化的7S球蛋白對(duì)11S球蛋白熱聚集的抑制機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。7S球蛋白糖基化可以作為一種抑制大豆蛋白熱聚集的新方法，對(duì)于我國(guó)豐富的大豆資源來(lái)說(shuō)，無(wú)疑是一種很好的拓寬其應(yīng)用范圍的途徑。

[1] 周瑞寶, 周兵. 大豆7S和11S球蛋白的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)[J]. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào), 1998, 6(13): 39-42.

[2] 李向紅, 劉展, 李偉, 等. 干燥方法對(duì)大豆分離蛋白熱誘導(dǎo)聚集體的影響[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào), 2008, 24(10): 258-261.

[3] DAMODARAN S, KINESELLA J E. Effect of conglycinin on the thermanl aggregation of glycinin[J]. Food Chemistry, 1982, 30: 812-817.

[4] 莫重文. 蛋白質(zhì)化學(xué)與工藝學(xué)[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2007: 179-183.

[5] 齊軍茹, 楊曉泉, 廖勁松, 等. 大豆蛋白與多糖的干熱反應(yīng)研究[J].食品科學(xué), 2005, 26(12): 45-47.

[6] KATO Y, AOKI T, KATO N, et al. Improvement of protein heat stability and emulsifying activity[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1995, 43: 301-305.

[7] AOKI T, HIIDOME Y, KITAHATA K, et al. Improvement of heat stability and emulsifying activity of ovalbumin by conjugation with glucuronic acid through the Maillard reaction[J]. Food Research International, 1999, 32: 129-133.

[8] LI Xianghong, CHENG Yunhui, YI Cuiping, et al. Effect of ionic strength on the heat-induced soy protein aggregation and the phase separation of soy protein aggregate/dextran mixtures[J]. Food Hydrocolloids, 2009,23(3): 1015-1023.

[9] NAGANO T, HIROTSUKA M, MORI H, et al. Dynamic viscoelastic study on the gelation of 7S globulin from soybeans[J]. Agric Food Chem, 1992, 40: 941-944.

[10] 齊軍茹, 楊曉泉, 廖勁松, 等. 大豆球蛋白與葡聚糖的干熱反應(yīng)特性[J]. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào), 2005, 20(6): 79-82.

[11] LAEMMLI U K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J]. Nature, 1970, 227: 680-685.

[12] 章莉娟. 膠體與界面化學(xué)[M]. 廣州: 華南理工大學(xué)出版社, 2006: 97-100.

[13] 李云, 華欲飛, 李向紅. 大豆蛋白預(yù)先熱聚集對(duì)其凝膠性質(zhì)的影響[J]. 食品科技, 2007(2): 29-32.

[14] 楊曉泉. 大豆蛋白的改性技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 廣州城市職業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào),2008, 2(3): 37-44.

[15] 朱建華, 楊曉泉, 陳剛. 大豆7S球蛋白和11S球蛋白的研究[J]. 糧油加工與食品機(jī)械, 2003(8): 37-39.

Effects ofβ-Conglycinin and Glycatedβ-Conglycinin on the Thermal Aggregation of Glycinin

SUN Wei-wei，YU Shu-juan*
(College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

TS214.2

A

1002-6630(2010)15-0159-04

2010-03-23

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20776050)；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(7006508)

孫煒煒(1988—)，男，碩士研究生，主要從事大豆蛋白與多糖的糖基化反應(yīng)研究。E-mail：sunweiwei409@yahoo.com.cn

*通信作者：于淑娟(1955—)，女，教授，博士，主要從事制糖工程、碳水化合物分子修飾研究。E-mail：lfshjyu@scut.edu.cn