比索洛爾與阿托伐他汀對高血壓大鼠心肌纖維化影響的實驗研究

李元珍,李 征,李茹香

心肌纖維化是多種心血管疾病(如高血壓、心肌梗死、心力衰竭、心律失常、猝死等)發(fā)展到一定階段的共同病理改變,因此,防止和逆轉(zhuǎn)心肌纖維化已成為治療心血管疾病的主要目的。β受體阻滯劑與他汀類藥物已廣泛應(yīng)用于臨床。本研究以腎性高血壓大鼠為模型,觀察在使用高選擇性β1受體阻滯劑比索洛爾的基礎(chǔ)上加用阿托伐他汀對高血壓心肌纖維化的影響,并探討其逆轉(zhuǎn)心肌纖維化的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 一般材料 雄性Wistar大鼠24只(購于山西醫(yī)科大學(xué)生理教研室,體重180 g～230 g),將其隨機(jī)分為3組,比索洛爾組、阿托伐他汀組、比索洛爾+阿托伐他汀組。用10%的水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔麻醉,開腹,用內(nèi)徑0.25 mm的銀夾鉗夾3組大鼠左側(cè)腎動脈使其部分狹窄,術(shù)后4周測尾動脈收縮壓,高于20 kpa者為高血壓模型制備成功。比索洛爾組用蒸餾水(1 mL)溶解的比索洛爾[(2 mg/(kg?d)],阿托伐他汀組用蒸餾水(1 mL)溶解的阿托伐他汀灌胃[50 mg/(kg?d)],聯(lián)合用藥組同時使用上述兩種藥物,連續(xù)觀察8周。

1.2 標(biāo)本采集與處理 術(shù)后12周末,用20%烏拉坦(4 mL/kg)麻醉大鼠,開胸取出心臟,以冰生理鹽水沖洗干凈,吸干水分,去除大血管、左右心房、右心室,取左心室并稱其重量即左心室重量(LVM)除以體重(BW)得到左室重量指數(shù)(LVMI)。將左室心肌標(biāo)本橫切分為兩份,中下段部分凍存與-70℃冰箱中,另取左室中上斷橫切面組織一塊,經(jīng)10%甲醛固定 24 h,常規(guī)脫水,石蠟包埋,制成 4 μ m切片,分別行心肌 VG染色,及MMP-9的免疫組化染色。

1.3 心肌羥脯氨酸(HC)濃度的測量 羥脯氨酸是膠原蛋白的主要成分,而且動物組織中的羥脯氨酸幾乎完全來自膠原,因此,心肌組織內(nèi)羥脯氨酸的含量可以代表膠原的水平,即反映心肌纖維化的程度。按試劑說明書,100 mg心肌組織勻漿、消化、水解、取上清,使用分光光度計在550 nm處測各管吸光度。羥脯氨酸濃度=[(測定管吸光度-空白管吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-空白管吸光度)]×標(biāo)準(zhǔn)管含量(5 μ g/mL)×[水解液總體積(10 mL)/組織濕重(mg)]。

1.4 心肌膠原纖維的半定量分析 組織切片進(jìn)行苦味酸-酸性品紅(VG)膠原染色,利用圖像分析系統(tǒng),測量心肌膠原灰度值(反映組織化學(xué)染色產(chǎn)物深淺程度,灰度值越大,則反應(yīng)產(chǎn)物濃度越小,反之,產(chǎn)物濃度越大)。測量心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF),CVF=膠原面積/總面積。每張切片隨機(jī)取(4～6)個視野取其平均值。

1.5 基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達(dá)水平測定 MM P-9采用SP三步法免疫組化染色,一抗為羊多抗IgG(購于北京中衫金橋有限公司),二抗為SPABC試劑盒(購于北京中衫金橋有限公司),按試劑盒說明書操作,利用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析,測量其灰度值,每張切片平均選取(4～6)個視野。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血壓、LVMI、HC及CVF結(jié)果(見表1) 與治療前相比,比索洛爾組及聯(lián)合用藥組治療后大鼠血壓明顯降低(P＜0.05),而阿托伐他汀組血壓略有下降,但治療前后相比無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。3組大鼠治療后較治療前LVMI、HC、CVF明顯改善(P＜0.05),且比索洛爾組對于改善 LVMI、HC、CVF優(yōu)于阿托伐他汀組(P＜0.05),聯(lián)合用藥組改善LVMI、HC、CVF優(yōu)于另外兩組(P＜0.05)。

表1 各組大鼠心肌LVMI、HC及CVF結(jié)果比較(±s)

表1 各組大鼠心肌LVMI、HC及CVF結(jié)果比較(±s)

組別 n SBP(mmHg) LVMI(mg/g) HC(μ g/mg) CVF比索洛爾組 治療前 8 175.43±16.53 1.87±0.20 81.3±3.4 2.01±0.52治療后 8 154.67±16.241)2) 1.08±0.231)2) 48.2±1.51)2) 1.29±0.321)2)阿托伐他汀組 治療前 8 178.75±16.87 1.93±0.23 79.4±3.6 1.99±0.50治療后 8 165.50±17.98 1.23±0.211) 50.1±1.31) 1.30±0.331)聯(lián)合用藥組 治療前 8 176.31±18.23 1.97±0.22 78.7±3.8 1.98±0.49治療后 8 142.51±17.971)3) 0.98±0.191)3) 40.6±1.11)3) 1.16±0.261)3)與同組治療前相比,1)P＜0.05;與阿托伐他汀治療后比較,2)P＜0.05;與比索洛爾組治療后比較,3)P＜0.05

2.2 心肌膠原組織學(xué)測定 各組大鼠心肌VG染色,顯微鏡下攝圖,間質(zhì)膠原為紫紅色,心肌細(xì)胞為黃色,治療后較治療前血管周圍及心肌間質(zhì)膠原明顯減少。

2.3 各組大鼠心肌MMP-9免疫組化染色及半定量分析 3組大鼠治療后較治療前MMP-9表達(dá)明顯降低,灰度值明顯升高(P＜0.05),比索洛爾組對于降低MMP-9表達(dá)優(yōu)于阿托伐他汀組(P＜0.05),聯(lián)合用藥組降低MMP-9表達(dá)優(yōu)于另外兩組(P＜0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠MM P-9免疫組化染色及半定量分析(±s)

表2 各組大鼠MM P-9免疫組化染色及半定量分析(±s)

組別 n MMP-9灰度值比索洛爾組 治療前 8 150.874±20.176治療后 8 161.351±16.2381)2)阿托伐他汀組 治療前 8 149.640±19.013治療后 8 153.844±12.8811)聯(lián)合用藥組 治療前 8 151.429±20.131治療后 8 168.657±17.3511)3)與同組治療前相比,1)P＜0.05;與阿托伐他汀治療后比較,2)P＜0.05;與比索洛爾組治療后比較,3)P＜0.05

3 討 論

高血壓是最常見的心腦血管疾病,高血壓的持續(xù)發(fā)展可引起心室重構(gòu)、心肌纖維化。心肌纖維化是指心肌間質(zhì)膠原濃度顯著升高及膠原特性構(gòu)型的改變,其形成機(jī)制非常復(fù)雜,涉及腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)及多種細(xì)胞因子,而各種細(xì)胞因子在影響心肌膠原合成和降解中的相互關(guān)系仍不十分清楚。在本實驗中,建立了腎血管性高血壓大鼠模型,通過測量大鼠LVM I,檢測HC濃度,VG染色檢測CVF,表明比索洛爾、阿托伐他汀、聯(lián)合用藥均可改善大鼠心肌纖維化,且比索洛爾組對于改善LVM I、HC、CVF優(yōu)于阿托伐他汀組(P＜0.05),聯(lián)合用藥組改善LVM I、HC、CVF優(yōu)于另外兩組(P＜0.05)。β受體阻滯劑可以同時阻滯交感神經(jīng)系統(tǒng)與腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng),可以降低心室率,降低心肌耗氧量,增加冠狀動脈的灌注。比索洛爾是一種高選擇性β1受體阻滯劑,降低血壓作用確切,且有可能降低心肌細(xì)胞促炎因子,逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)。近年來,隨著幾個大規(guī)模臨床試驗的揭曉,證實β受體阻滯劑可以減退心臟功能下降,阻止并逆轉(zhuǎn)左心室肥厚,改善心臟本身的收縮功能及心力衰竭患者的預(yù)后,降低病死率[1,2]。β受體阻滯劑因其獨特的藥理特性已成為臨床及基礎(chǔ)研究中一個令人矚目的熱點。本研究顯示,以比索洛爾為代表的高選擇性β受體阻滯劑治療腎性高血壓大鼠血壓療效確切,且有效逆轉(zhuǎn)大鼠心肌纖維化,其作用與抑制M MP-9的表達(dá)有關(guān)。

近年來的一系列大規(guī)模實驗如4S、CARE、LIPID等均表明他汀類藥物除調(diào)脂外還具有重要的非調(diào)脂作用,如穩(wěn)定粥樣硬化斑塊、防止心室重構(gòu)、抗血栓等。他汀類的這種多效性作用正日益受到人們的重視,使其成為心血管病治療中的基礎(chǔ)性用藥之一,其作用機(jī)制可能與抑制平滑肌細(xì)胞增殖、遷移,保護(hù)血管內(nèi)膜,舒張血管,抑制心肌纖維膠原合成等有關(guān),但他汀類藥物是否可以明顯降低血壓及其抗心肌纖維化的具體機(jī)制仍不明確。Pasquale等[3]納入887例患者進(jìn)行薈萃分析結(jié)果顯示,他汀類藥物組的收縮壓比對照組平均低1.9 mmHg(P＜0.05)。而本實驗阿托伐他汀組治療后與治療前相比,大鼠收縮壓雖有下降趨勢,卻無統(tǒng)計學(xué)意義,可能與本實驗的樣本量較小、治療持續(xù)時間短有關(guān)。

在眾多的細(xì)胞因子之中,MMP-9是心肌纖維化的重要調(diào)控因素。MM P-9又稱明膠酶B,是降解Ⅳ型膠原的主要成員之一,不僅在心臟基質(zhì)成分的降解中起作用,而且還調(diào)節(jié)膠原蛋白的合成。Sakata等[4]高血壓型 HF大鼠模型,第 23周左室無擴(kuò)大,但MMP-2和MMP-9的mRNA水平與酶活性水平升高。第26周左室擴(kuò)大,HF并且出現(xiàn)肺水腫,提示MM P-2和MM P-9升高早于左室擴(kuò)大,是反映心肌纖維化的早期敏感指標(biāo)。MM P-9表達(dá)的上調(diào),參與許多心血管疾病的發(fā)生發(fā)展,而MMP-9的抑制劑則可以減弱心室重構(gòu),改善心功能。Tziakas等[5]的研究顯示,阿托伐他汀治療可降低ACS患者M(jìn)MP-9水平。本研究顯示,3組大鼠治療后較治療前M MP-9表達(dá)明顯降低,灰度值明顯升高(P＜0.05),比索洛爾組對于降低MM P-9表達(dá)優(yōu)于阿托伐他汀組(P＜0.05),聯(lián)合用藥組降低MM P-9表達(dá)優(yōu)于另外兩組(P＜0.05)。

比索洛爾、阿托伐他汀均能有效抑制大鼠心肌纖維化的形成,其機(jī)制與降低MM P-9表達(dá)水平有關(guān),且比索洛爾療效優(yōu)于阿托伐他汀,聯(lián)合用藥組療效更加明顯,二者之間存在協(xié)同作用。

[1]Simon T,Mary-Krause M,Funck-Brentano C,et al.Bisoprohol dose-response relationship in patients,with congestive heart failure,a subgroup analysis in the cardiac insufficiency bisoprolol study(CIBISIⅡ)[J].Eur Heart J,2003,24(6):552-559.

[2]Gullestad L,Manhenke C,Aarsland T,et al.Effect of metoprolol CR/XL on exercise tolerance in chronic heart failure:A substudy to the MERIT-HF trial[J].Eur J Heart fail,2001,3(4):463-468.

[3]Pasquale S,Sally MK.Do statins reduce blood pressure A meta-analysis of randomized,controlled trials[J].Hypertensions,2007,49(4):792-798.

[4]Sakata Y,Yamamoto Y,Mano T,et al.Activation of matrix metalloproteinases precedes left ventricular remodeling in hypertensive heart failure rats:Its inhibition as a primary effect of angiotensinconverting enzyme inhibitor[J].Circulation,2004,109(17):2143-2149.

[5]Tziakas DN,Chalikias GK,Parissis JT,et al.Serum profiles of matrix metalloproteinases and their tissue inhibitor in patients with acute coronary sy ndromes.T he effects of short-term atorvastatin administration[J].Int J Cardiol,2004,94(2-3):269-277.