誘導(dǎo)型一氧化氮合酶在衰老大鼠心肌對缺血再灌注損傷敏感性增加中的作用1)

田 玨,燕 子,王 瑾,馬秀瑞,呂婷婷,劉慧榮

大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明,衰老心臟對缺血再灌注損傷較成年更為敏感[1,2],衰老的心臟梗死面積大、病人的療效和預(yù)后差[3-5]。全球60歲以上衰老人口比例將從2000年的10.0%增至2050年的21.8%、2100年的32.2%[6]。這促使我們要努力揭示衰老對心肌缺血再灌注損傷的敏感性增加的機(jī)制,進(jìn)而尋求更有效的防治措施。有研究表明衰老大鼠心肌缺血再灌注時(shí)過氧亞硝基陰離子(ONOO-)含量增加[7],但ONOO-的增加與心肌缺血再灌注損傷敏感性增加的關(guān)系有待進(jìn)一步證實(shí),ONOO-增加的原因也有待進(jìn)一步研究。一氧化氮(NO)及其衍生物活性氮簇(RNS)具有促凋亡和抗凋亡的雙重作用,普遍認(rèn)為低濃度/低活性的RNS,如:eNOS催化生成的NO具有細(xì)胞保護(hù)作用;高濃度/高活性的RNS,如:iNOS催化生成的NO及其與超氧化物的雙自由基反應(yīng)產(chǎn)物ONOO-具有細(xì)胞毒性[8-11],衰老大鼠心肌缺血再灌注時(shí)ONOO-含量增加是否與iNOS有關(guān),目前仍不清楚。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠,成年大鼠(4～6月齡),衰老大鼠(22～24月齡),購自四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。隨機(jī)分為 3組,成年缺血再灌注組(缺血30 min,再灌注24 h)、衰老缺血再灌注組(缺血30 min,再灌注24 h),衰老缺血再灌注+1 400W 組(缺血 30 min,再灌注 24 h,缺血前 24 h及再灌注前25 min分別腹腔注射iNOS特異性阻斷劑1 400 W,2 mg/kg)。每組6只。

1.2 在體大鼠心肌缺血再灌注模型的建立 10%水合氯醛麻醉動(dòng)物。行氣管插管,機(jī)械通氣,頻率60/min,潮氣量 8 mL,吸呼比1:2。連接心電電極檢測Ⅱ?qū)碾妶D。沿胸骨左緣心臟搏動(dòng)處縱行切開皮膚約2 cm,將6-0無創(chuàng)縫合針于左心耳根部下方2 mm處穿過心肌表層,在肺動(dòng)脈圓錐旁出針。觀察心電圖,待其恢復(fù)穩(wěn)定15 min后打一活結(jié)以結(jié)扎左冠脈前降支(LAD),心肌缺血成功的標(biāo)志為:心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST段弓背向上抬高0.4 mV以上。30 min后松結(jié)扎線,心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST段下降1/2以上作為心肌組織恢復(fù)血液灌流的標(biāo)志。缺血30 min,再灌注 24 h。

1.3 心肌梗死面積測定 心肌缺血30 min再灌注24 h后,再次結(jié)扎 LAD,經(jīng)股靜脈注入2%Evans blue,30 s～60 s內(nèi)摘取心臟,用掃描儀對心臟切面進(jìn)行掃描,利用Image-ProPlus5.0圖像分析系統(tǒng)分析,分別測定藍(lán)色、紅色、白色區(qū)域面積,左心室面積(left ventricle,LV)為藍(lán)色、紅色和白色面積之和;危險(xiǎn)區(qū)總面積(area at risk,AAR)為紅色和白色面積之和;梗死區(qū)面積(area of necrosis,AN)為白色面積。結(jié)果以危險(xiǎn)區(qū)面積與左心室面積的比值來判斷手術(shù)手法有無差異性,以梗死區(qū)面積與危險(xiǎn)區(qū)總面積的比值來表示心肌梗死面積大小。

1.4 心肌組織硝基酪氨酸含量檢測 應(yīng)用雙抗體夾心ELISA法檢測BCA法檢測蛋白濃度。使用酶標(biāo)儀在波長490 nm處測定光密度(OD)值。用含有已知?jiǎng)┝肯趸野彼岬?、硝酸化的BSA制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算組織樣本中硝基酪氨酸含量,結(jié)果用每克蛋白含硝基酪氨酸量表示。

1.5 Western-blot測定iNOS蛋白表達(dá) 利用SDS-PAGE電泳技術(shù)分離組織勻漿中的蛋白,再轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,用iNOS單克隆抗體(BD Transduction Laboratories)進(jìn)行免疫印跡檢測心肌組織iNOS含量。以大鼠心肌組織GAPDH的蛋白表達(dá)量作為內(nèi)參。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析,兩樣本均數(shù)組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 年齡因素對缺血再灌注大鼠心肌梗死面積的影響心肌缺血再灌注后,衰老大鼠心梗面積較成年大鼠明顯增大(P＜0.05)。YI/R為成年缺血再灌注組;OI/R為衰老缺血再灌注組;OI/R+1400W為衰老缺血再灌注+1400W組。詳見圖1。

圖1 各組心肌梗死面積比較

2.2 衰老組大鼠心肌ONOO-含量 衰老缺血再灌注組心肌組織NT含量較成年缺血再灌注組明顯增高(7.29±0.1vs 3.2±0.1,P＜0.05)。詳見圖 2。

2.3 衰老組大鼠心肌組織iNOS表達(dá)增高 與正常成年大鼠比較,正常衰老大鼠iNOS表達(dá)升高(P＜0.05);與成年缺血/再灌注組比較,衰老缺血/再灌注組iNOS表達(dá)升高(P＜0.05)。詳見圖3。

圖3 各組心肌組織iNOS的表達(dá)

2.4 衰老大鼠心肌組織中NT含量 用iNOS的特異性阻斷劑1 400 W阻斷iNOS后發(fā)現(xiàn),缺血再灌注后,衰老大鼠心肌組織的 NT明顯下降(P＜0.05)。詳見圖2。

2.5 衰老大鼠梗死面積 衰老心肌缺血再灌注+1400W組大鼠心梗面積較衰老心肌缺血再灌注組明顯減小(P＜0.05)。詳見圖1。

3 討 論

缺血再灌注損傷直接影響著缺血性疾病的治療效果和預(yù)后,衰老的心臟對缺血再灌注損傷的敏感性增加,衰老患者溶栓率低、心衰、休克、心律失常等并發(fā)癥較為常見,病死率高[12]。

凋亡在心肌再灌注損傷中發(fā)揮重要作用,降低心肌細(xì)胞凋亡可以顯著減少心梗面積,改善心功能。已有研究顯示衰老時(shí)心肌細(xì)胞凋亡增加,如能揭示衰老時(shí)心肌細(xì)胞凋亡增加的潛在機(jī)制,有利于解釋衰老時(shí)心臟對缺血再灌注損傷易感性增加的原因,還可能為特異性扭轉(zhuǎn)機(jī)體這一系列損傷提供新的思路。

前期的研究結(jié)果表明,心肌缺血再灌注時(shí),衰老大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)和Caspase-3的活性明顯高于成年大鼠,提示衰老大鼠對心肌缺血再灌注損傷的敏感性增加;同時(shí)發(fā)現(xiàn)衰老大鼠缺血再灌注心肌組織ONOO-含量增加。但ONOO-增加與衰老大鼠對心肌缺血再灌注損傷的敏感性增加的關(guān)系有待進(jìn)一步明確,ONOO-的來源也有待研究。本實(shí)驗(yàn)觀察到,衰老大鼠缺血再灌注時(shí)心梗面積較成年大鼠增大,衰老心肌組織缺血再灌注時(shí)ONOO-的水平增高,同時(shí)衰老大鼠iNOS表達(dá)升高,當(dāng)給予iNOS特異性阻斷劑1 400 W后,衰老大鼠缺血再灌注心肌組織ONOO-下降,同時(shí)心梗面積減小。因此衰老大鼠對心肌缺血再灌注損傷敏感性增加可能是由于衰老心臟中iNOS表達(dá)升高,催化生成大量NO進(jìn)而生成毒性的ONOO-,從而損傷引起心肌損傷。

本研究結(jié)果提示,在臨床治療中或許可以通過降低iNOS表達(dá)、抑制iNOS活性或使用ONOO-解毒劑來部分減輕老年患者對心肌缺血再灌注損傷的敏感性,從而提高老年冠心病患者的療效,降低病死率,改善老年冠心病患者的生命質(zhì)量。但為何衰老的心肌iNOS表達(dá)會(huì)增高?升高的NO及其毒性衍生物ONOO-又是通過何種機(jī)制使得衰老心肌凋亡增加、對缺血再灌注損傷更加敏感?這些均有待于進(jìn)一步研究,以更好地揭示衰老心臟對缺血再灌注損傷易感性增加的機(jī)制。

[1]Kostyak JC,Hunter JC,Korzick DH.Acute PKCdelta inhibition limits ischaemia-reperfusion injury in the aged rat heart:Role ofGSK-3beta[J].Cardiovasc Res,2006,70(2):325-334.

[2]Lakatta EG,Levy D.Arterial and cardiac aging:Major shareholders in cardiovascular disease enterprises:Part I:Aging arteries:A“set up” for vascular disease[J].Circulation,2003,107(1):139-146.

[3]Gould KE,T affet GE,Michael LH,et al.Heart failure and greater infarct expansion in middle-aged mice:A relevant model for postinfarction failure[J].Am J Phy siol Heart Circ Phy siol,2002,282(2):H615-H621.

[4]Abete P,Testa G,Ferrara N,et al.Cardioprotective effect of ischemic preconditioning is preserved in food-restricted senescent rats[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2002,282(6):H1978-H987.

[5]White HD,Barbash GI,Califf RM,et al.Age and outcome with contemporary thrombolytic therapy.Resultsfrom the GUSTO-I trial.Global Utilization of Streptokinase and TPA for occluded co ronary arteries trial[J].Circulation,1996,94(8):1826-1833.

[6]Lutz W,Sanderson W,Scherbov S.The coming acceleration of global population ageing[J].Nature,2008,451(7179):716-719.

[7]武燁,王曉樑,燕子,等.衰老大鼠心肌對缺血再灌注損傷的敏感性研究[J].中華老年醫(yī)學(xué)雜志,2006,25(12):912-915.

[8]Beckman JS,Koppenol WH.Nitric oxide,superoxide,and peroxynitrite:The good,the bad,and ugly[J].Am J Phy siol,1996,271(5 Pt 1):C1424-437.

[9]Boy d CS,Cadenas E.Nitric oxide and cell signaling pathways in mitochondrial-dependent apoptosis[J].Biol Chem,2002,383(3-4):411-423.

[10]Fierro IM,Nascimento-DaSilva V,Arruda MA,et al.Induction of NOS in rat blood PMN in vivo and in vitro:Modulation by tyrosine kinase and involvement in bactericidal activity[J].J Leukoc Biol,1999,65(4):508-514.

[11]Wheeler M A,Smith SD.Bacterial infection induces nitric oxide synthase in human neutrophils[J].J Clin Invest,1997,99(1):110-116.

[12]侯維寧,陳銳,簡振堯.老年急性心肌梗死的臨床特點(diǎn)、影響因素與處理[J].中國心血管病研究雜志,2003,1(2):102-103.