悅目金蛛和棒絡(luò)新婦卵袋絲物理化學(xué)結(jié)構(gòu)表征及其力學(xué)性能研究

蔣平,呂太勇,肖永紅,曾建忠,周兵,郭聰

1.井岡山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西吉安343009；

2.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610064

悅目金蛛和棒絡(luò)新婦卵袋絲物理化學(xué)結(jié)構(gòu)表征及其力學(xué)性能研究

蔣平1,呂太勇1,肖永紅1,曾建忠1,周兵1,郭聰2

1.井岡山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西吉安343009；

2.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610064

蜘蛛絲是一種具有優(yōu)良機(jī)械性能的天然動(dòng)物蛋白纖維，它特有的結(jié)構(gòu)和性能與其生物學(xué)功能密切相關(guān)。作者采用氨基酸自動(dòng)分析儀、傅立葉轉(zhuǎn)換紅外光譜儀、掃描電鏡和電子單纖強(qiáng)力儀對(duì)悅目金蛛（Argiope amoena）和棒絡(luò)新婦（Nephila clavata）的卵袋絲進(jìn)行了物理化學(xué)結(jié)構(gòu)表征與力學(xué)性能的研究，結(jié)果表明兩種蜘蛛卵袋均由微米級(jí)柱狀腺絲、大壺狀腺絲、亞微米級(jí)或納米級(jí)葡萄狀腺絲構(gòu)成。卵袋絲的表面形貌特征、極性氨基酸含量、大側(cè)鏈與小側(cè)鏈氨基酸的比值、無(wú)定型區(qū)、β-折疊結(jié)構(gòu)與結(jié)晶結(jié)構(gòu)的含量等氨基酸組成種類與蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)特征，均滿足各自生物學(xué)功能對(duì)斷裂強(qiáng)度、延展性、初始模量等力學(xué)性能的要求。

蜘蛛；卵袋絲；物理化學(xué)結(jié)構(gòu)；力學(xué)性能

0 引言

很長(zhǎng)一段時(shí)間以來(lái)，人們一直認(rèn)為蜘蛛絲和蠶絲都是蛋白質(zhì)晶體包埋在蛋白質(zhì)膠體中形成的復(fù)合物質(zhì)[1～3]，但現(xiàn)在這種觀點(diǎn)早已被否定，研究表明蜘蛛絲和蠶絲包含長(zhǎng)的微纖絲和其它微觀結(jié)構(gòu)[4～9]。對(duì)蜘蛛拖牽絲蛋白基因的測(cè)序表明，蜘蛛絲蛋白分子鏈由多種重復(fù)多肽序列組成，多肽序列分為4類：1）(GPGXX)n／(GPGQQ)n；2）An／(GA)n；3）(GGX)n；4）任意序列[10]。

人們采用紅外光譜[11]、單纖X晶體衍射[12～14]、拉曼光譜[15～17]、核磁共振[18～21]等研究手段，對(duì)蜘蛛拖牽絲蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行的大量研究分析表明，蜘蛛絲是一種半結(jié)晶的高分子聚合物，含有結(jié)晶相和非結(jié)晶相。結(jié)晶相主要由An或(GA)n氨基酸基序構(gòu)成的、沿絲纖維長(zhǎng)軸方向排列的反平行β-折疊構(gòu)成；肽鏈分子間相互以氫鍵結(jié)合，形成排列整齊、密集的片層結(jié)構(gòu)，分子間作用力很大，賦予蜘蛛絲的高強(qiáng)度和高模量；非結(jié)晶相是由無(wú)定型結(jié)構(gòu)和微孔[6]構(gòu)成，β-折疊片層之間的富含甘氨酸的(GGX)n或(GPGXX)n或(GPGQQ)n基序構(gòu)成了無(wú)定型區(qū)。(GGX)n基序可能形成310螺旋結(jié)構(gòu)，而(GPGXX)n或(GPGQQ)n基序形成類似β轉(zhuǎn)角的彈性螺旋結(jié)構(gòu)[18,22]，這些結(jié)構(gòu)賦予蜘蛛絲良好的延展性和彈性。由于蜘蛛絲是為蜘蛛的生存與繁殖設(shè)計(jì)的，因此其特有的結(jié)構(gòu)和性能是與它的生物學(xué)功能密切相關(guān)的[2,23]。蜘蛛體內(nèi)有9種絲腺(并不是每種蜘蛛同時(shí)都具有這9種絲腺)，能紡出多種不同組成、結(jié)構(gòu)、性能和功能的絲蛋白纖維，如園蛛能產(chǎn)生7種不同特性的絲，各具不同的生物學(xué)功能[23～26]。

對(duì)蜘蛛絲蛋白結(jié)構(gòu)的大量研究主要集中于紡自大壺狀腺的拖牽絲，近年來(lái)由柱狀腺紡出的卵袋絲[27～30]以及其它絲腺[26]，如小壺狀腺、葡萄狀腺等[31～33]紡出的蛛絲蛋白纖維愈來(lái)愈受到人們的關(guān)注。Casem、Foradori、潘志娟、蔣平等[34～37]的研究表明，蜘蛛卵袋覆蓋層絲(特別是內(nèi)層絲)和卵袋框架絲是分別由柱狀腺和大壺狀腺紡出的具有不同功能的兩種蜘蛛絲，那么與拖牽絲相比，卵袋覆蓋層絲氨基酸含量的變化，特別是卵袋內(nèi)層絲絲氨酸百分含量的驟然增加，以及同時(shí)伴隨的甘氨酸含量的驟然降低，將怎樣影響卵袋絲蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)與力學(xué)性能呢？為此，本文采用氨基酸自動(dòng)分析儀、傅立葉轉(zhuǎn)換紅外光譜儀、掃描電鏡和電子單纖強(qiáng)力儀對(duì)悅目金蛛和棒絡(luò)新婦的卵袋絲進(jìn)行了物理化學(xué)結(jié)構(gòu)表征與力學(xué)性能的研究。探討了氨基酸組成的改變對(duì)蜘蛛絲二級(jí)結(jié)構(gòu)與力學(xué)性能的影響及與其生物學(xué)功能之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 蜘蛛與卵袋

實(shí)驗(yàn)所用的悅目金蛛和棒絡(luò)新婦均采自米易縣安寧河旁的公園(東經(jīng)102.06°，北緯26.88°)。體長(zhǎng)15～21 mm，重300 mg以上，均為成體，放入60 cm×60 cm×60 cm籠中，用蚊蟲喂養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為：(24.5±2.0)℃，相對(duì)濕度50%±5%，L∶D=12∶12(h)。在蜘蛛織制完卵袋后，立即收集卵袋備用。

1.2 卵袋解剖與蜘蛛絲樣品的準(zhǔn)備

用刀片或剪刀從一個(gè)完整的卵袋（圖1A，圖2A）上將鉚釘和支持卵袋的金黃色框架絲取下，然后用鑷子小心地將卵袋各層分開，收集不同顏色的卵袋覆蓋層絲備用。采用人工抽絲的方法獲得悅目金蛛的拖牽絲。收集籠中水平的絲束，獲得棒絡(luò)新婦自然紡出的拖牽絲。

1.3 蜘蛛卵袋絲超微形貌觀察

將各卵袋層或絲纖維用雙面膠貼在樣品臺(tái)上，用金粉噴鍍5 min后，直接送入樣品室進(jìn)行觀察(JEOL JSM-5900日本電子株式會(huì)社，觀察條件：U=20 kV，I=0.6 nA)，絲纖維的直徑使用Smileview軟件進(jìn)行測(cè)量。

1.4 氨基酸組成分析

稱取1～2 mg蜘蛛絲，酸水解，然后送到四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心使用L8000（Hitachi,Japan）氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行氨基酸組成分析。

1.5 紅外光譜分析

采用KBr固體壓片制樣的方法[39]：KBr經(jīng)400℃高溫灼燒4 h，在保干器中冷卻到室溫稱重制樣，并做了KBr空白對(duì)照。共測(cè)試8個(gè)蛛絲樣品：悅目金蛛和棒絡(luò)新婦的拖牽絲、卵袋框絲、卵袋內(nèi)層絲、悅目金蛛卵袋灰綠色外層絲和白色外覆蓋層絲。在制樣前，絲樣品進(jìn)行了干燥的，已排除水分對(duì)結(jié)構(gòu)的影響。測(cè)試儀器為Nicole公司生產(chǎn)的170SX型紅外光譜儀，在中紅外區(qū)4,000～400 cm－1范圍內(nèi)對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定。

1.6 力學(xué)性能的測(cè)試

采用LLY-06B型（萊州市電子儀器有限公司）電子單纖強(qiáng)力儀對(duì)兩種蜘蛛的卵袋框絲和內(nèi)層絲進(jìn)行了拉伸測(cè)試，測(cè)試條件：夾持距20 mm，下降速度10 mm/min，溫度20℃，濕度為65%。將拉伸試驗(yàn)斷裂后的樣品噴金，用掃描電鏡觀測(cè)樣品的外貌，測(cè)定其沿絲長(zhǎng)軸旋轉(zhuǎn)90°前后兩個(gè)位置的直徑值，然后可通過(guò)如下表達(dá)式，從實(shí)驗(yàn)測(cè)得的直徑得到其斷裂前的任意伸長(zhǎng)狀態(tài)下絲纖維的直徑與截面面積[38]：

D0和D分別表示斷裂前后的蠶絲直徑，π(D0/2)2和π(D/2)2，分別表示斷裂前后的橫截面面積，L0和L分別表示原始和最終樣品長(zhǎng)度。從等式中可看出，拉伸測(cè)試中樣品體積保持不變，以前有關(guān)蠶絲的研究中也一直利用這一關(guān)系[42]。由這些面積把相對(duì)應(yīng)的負(fù)載-位移曲線轉(zhuǎn)換成應(yīng)力-應(yīng)變曲線，斷裂能通過(guò)計(jì)算應(yīng)力-應(yīng)變曲線與橫坐標(biāo)圍成的面積獲得。上述所有實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均很小心，以避免將絲纖維拉伸。

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理使用SPSS13.0軟件完成，采用one-way-ANOVA分析，在進(jìn)行單因素方差分析前，檢驗(yàn)了數(shù)據(jù)正態(tài)性和方差齊性，所有數(shù)據(jù)表示為平均值依標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果

2.1 卵袋絲的物理結(jié)構(gòu)表征

SEM觀察表明，悅目金蛛與棒絡(luò)新婦的卵袋主要是由大壺狀腺紡出的框架絲與柱狀腺和葡萄狀腺紡出的覆蓋層絲構(gòu)成，其中框絲和柱狀腺絲直徑分別約為8 μm和5～12 μm；而葡萄狀腺絲直徑為260～800 nm（圖1和2）。卵袋框絲與典型蛛絲拖牽絲一樣，表面較為光滑細(xì)膩，個(gè)別絲樣品隱約可見縱向的條紋；而卵袋內(nèi)層絲表面不光滑，較為粗糙，可見沿絲纖維縱向周期性分布的清晰溝槽與條紋（圖1F與圖2F）。

2.2 氨基酸組成

卵袋框絲與拖牽絲均由大壺狀腺紡出，因此它們的氨基酸組成特征相似，甘氨酸和丙氨酸的含量最豐富，共占45%至56%左右；其次分別是谷氨酸、絲氨酸、亮氨酸和脯氨酸。棒絡(luò)新婦卵袋外覆蓋層絲的氨基酸組成也與其卵袋框絲和拖牽絲相似。與拖牽絲和卵袋框絲相比，棒絡(luò)新婦卵袋內(nèi)層絲與悅目金蛛卵袋內(nèi)外層絲的氨基酸組成發(fā)生了重要變化：絲氨酸的含量顯著增加，占20%左右；與此同時(shí)甘氨酸的含量顯著減少，只占6.5%左右；丙氨酸的含量變化不大，仍占了22%左右；谷氨酸的含量略有下降；天冬氨酸和蘇氨酸的含量較高；脯氨酸的含量較低（表1）。與卵袋框絲相比，由于甘氨酸含量的減少和絲氨酸的含量增加，卵袋內(nèi)層絲纖維的極性氨基酸含量較高。

圖1 悅目金蛛卵袋絲掃描電鏡圖(A)卵袋；(B)卵袋框架大壺狀腺絲；(C,D)灰綠色與白色卵袋外層絲(含有大直徑的柱狀腺絲與少量的小直徑的葡萄狀腺絲)；(E，F(xiàn))棕色卵袋內(nèi)層絲(僅含有大直徑的柱狀腺絲，可見絲表面的沿絲纖維縱向周期性分布的清晰溝槽和條紋)Fig.1 SEM morphologies ofA.amoenaegg case silks(A)Egg case;(B)Major ampullate silk in the egg case frame;(C,D)Graygreen and white outer cover silk(containing large diameter cylindrical and fine aciniform silk);(E,F)Umber inner cover silk(containing cylindrical silk,the apparentlongitudinalstrandsorstripeswere presented on its surface)

圖2 棒絡(luò)新婦卵袋絲掃描電鏡圖(A)卵袋；(B)卵袋框架大壺狀腺絲；(C)卵袋外層絲(含有大直徑的大壺狀腺絲與少量小直徑其它類型絲纖維，如葡萄狀腺絲等)；(D,E)白色卵袋內(nèi)層絲(含有大直徑的柱狀腺絲與少量小直徑其它類型絲纖維，如葡萄狀腺絲等)；(F)卵袋內(nèi)層絲(可見絲表面的沿絲纖維縱向周期性分布的清晰溝槽和條紋)Fig.2SEMmorphologiesofN.clavataegg case silks(A)Egg case;(B)Major ampullate silk in the egg case frame;(C)Outer cover silk(mainly containing large diameter major ampullate silk and othersometypesof smalldiametersilk,e.g. aciniform silk);(D,E)Inner cover silk(containing largediametercylindricalsilkandothersome types of small diameter silk,e.g.aciniform silk); (F)Inner cover silk(cylindrical silk,the apparent longitudinal strands or stripes were presented on its surface)

2.3 紅外光譜分析

兩種蜘蛛卵袋絲紅外光譜特征峰的頻率范圍主要集中在800～1,700 cm－1之間，均出現(xiàn)了酰胺Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的特征譜帶（圖3～5）。卵袋內(nèi)層絲和人工抽拖牽絲在約1,626 cm－1和1,695 cm－1處出現(xiàn)了小背；人工抽拖牽絲與棒絡(luò)新婦卵袋內(nèi)層絲都在約1,540 cm－1出現(xiàn)了小背；只有悅目金蛛和棒絡(luò)新婦的卵袋框絲及棒絡(luò)新婦的拖牽絲在約960 cm－1處出現(xiàn)了明顯的多聚丙氨酸吸收峰。

2.4 力學(xué)性能

表2匯總了兩種主要卵袋絲的力學(xué)性能參數(shù)，表明棒絡(luò)新婦卵袋框架絲具有較大的初始模量、斷裂強(qiáng)度和斷裂能，但其延展性較差，屈服點(diǎn)較低；而卵袋內(nèi)層絲的初始模量和斷裂強(qiáng)度較低，但其斷裂能與延展性較好，屈服點(diǎn)較高。悅目金蛛卵袋框絲與內(nèi)層絲都表現(xiàn)出較高的模量、斷裂強(qiáng)度和斷裂能，但內(nèi)層絲比框絲具有較高的屈服點(diǎn)、延展性與斷裂能。此外，卵袋框架絲單絲纖維的拉伸行為的重復(fù)性較差；而卵袋內(nèi)層絲單絲纖維的拉伸行為具有良好的重復(fù)性。

圖3 悅目金蛛網(wǎng)絲的紅外光譜圖(A)卵袋金黃色框架大壺狀腺絲；(B)人工抽拖牽絲與；(C)卵袋棕色內(nèi)層絲Fig.3FTIR spectra of web silk form theA.amoena(A)Golden major ampullate silk from the egg case frame;(B)White dragline silk(artificially reeled);(C)Egg case umber inner cover silk

圖4 悅目金蛛卵袋絲的紅外光譜圖(A)灰綠色外覆蓋層絲；(B)白色外覆蓋層絲；(C)棕色內(nèi)層絲Fig.4FTIR spectra of theA.amoenaegg case silk(A)Greygreen outer cover silk;(B)White outer cover silk;(C)Umber inner cover silk

圖5 棒絡(luò)新婦網(wǎng)絲的紅外光譜圖(A)卵袋金黃色框架大壺狀腺絲；(B)金黃色拖牽絲；(C)卵袋內(nèi)層絲Fig.5FTIR spectra of web silk form theN.clavata(A)Golden major ampullate silk from the egg case frame;(B)Golden dragline silk(naturally spun);(C)Egg case inner cover silk

表2 悅目金蛛和棒絡(luò)新婦卵袋框絲與內(nèi)層絲的力學(xué)性能Table 2Tensile parameters of the scaffolding silk and inner cover silk of theN.clavataand A.amoenaegg case

3 討論

3.1 卵袋絲的物理結(jié)構(gòu)表征

棒絡(luò)新婦卵袋覆蓋層的絲纖維種類比悅目金蛛較為復(fù)雜，含有除大直徑柱狀腺絲、大壺狀腺絲與小直徑葡萄狀腺絲以外的其它類型的蛛絲，其絲腺來(lái)源還需進(jìn)一步研究確定。與框絲和拖牽絲相比，卵袋覆蓋層絲具有截然不同的物理結(jié)構(gòu)表征，其主要組成纖維柱狀腺絲表面不光滑，較為粗糙，具有沿絲纖維縱向周期性分布的清晰溝槽和條紋，這些溝槽和條紋可能是在成絲過(guò)程中液態(tài)絲蛋白流動(dòng)而形成的，同時(shí)具有原纖結(jié)構(gòu)的特征[44]。這一結(jié)構(gòu)一方面減小了絲的橫截面面積，可增強(qiáng)絲的力學(xué)性能，如斷裂強(qiáng)度等[45]；另一方面增加了絲的表面積和粗糙度，可能有助于剛孵化的若蛛攀附，有利于其發(fā)育生長(zhǎng)。其它種類的蜘蛛，如大腹園蛛(Araneus ventricosus)[44]、金蛛(Argiope argentata)[45]、園蛛(Zygiella x-notata)[46]、橫紋金蛛(Argiope bruennichi)、肩斑銀鱗蛛(Leucauge blanda)、摩鹿加云斑蛛(Cyrtophora moluccensis)（蔣平等，未發(fā)表），卵袋內(nèi)層絲也呈現(xiàn)出相似的微觀形貌結(jié)構(gòu)，暗示這一結(jié)構(gòu)是這類絲的普遍特征。微米級(jí)的柱狀腺絲（5～12 μm）與少量的納米級(jí)的葡萄狀腺絲（260～800 nm）混合在一起構(gòu)成了卵袋外覆蓋層，這保證了卵袋具有相對(duì)較好的密閉性，為卵塊或若蛛提供了安全的庇護(hù)所與穩(wěn)定的微環(huán)境，以避免胚胎發(fā)育、孵化和蛻皮過(guò)程中受到溫度和濕度波動(dòng)的影響，直到它們爬出卵袋（出蟄）[37]。

3.2 氨基酸組成

Garb等[28]的研究表明，絲心蛋白在進(jìn)化上是保守的。本研究中兩種蜘蛛卵袋覆蓋層絲（棒絡(luò)新婦卵袋外層絲除外）的氨基酸組成，與親緣關(guān)系較近的其它種類蜘蛛的絲心蛋白TuSp1的組成相似，因此，我們認(rèn)為絲心蛋白TuSp1是這兩種蜘蛛卵袋覆蓋層絲的主要蛋白成分。棒絡(luò)新婦卵袋內(nèi)層絲和悅目金蛛卵袋外層絲的氨基酸組成與典型的柱狀腺絲相似，而棒絡(luò)新婦卵袋外層絲的氨基酸組成與典型的大壺狀腺絲相似，結(jié)合掃描電鏡圖片分析，表明它們分別主要由大直徑的柱狀腺絲與大壺狀腺絲構(gòu)成，中小直徑絲纖維的含量比較少；而悅目金蛛卵袋內(nèi)覆蓋層只含有柱狀腺絲。Vasanthavada等[47]從Latrodectus hesperus（黑寡婦）卵袋中分離鑒定到了葡萄狀腺絲心蛋白AcSp1-like，為葡萄狀腺細(xì)絲參入蜘蛛卵袋覆蓋層提供了直接的分子生物學(xué)證據(jù)。氨基酸組成與掃描電鏡的結(jié)果分析表明，本文研究的兩種蜘蛛的卵袋也含有葡萄狀腺細(xì)絲。根據(jù)氨基酸R-基的性質(zhì)將兩種蜘蛛卵袋絲與拖牽絲所含的氨基酸分類匯總于表3?？梢钥闯?，與拖牽絲和卵袋框絲相比，盡管柱狀腺絲蛋白小側(cè)鏈絲氨酸的含量增加了，但同時(shí)一些大側(cè)鏈氨基酸（如天冬氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸）的含量也都增加了。因此，柱狀腺絲的LC∶SC的比值為1.0左右（表3），均比拖牽絲和卵袋框絲的大。而家蠶蠶絲小側(cè)鏈氨基酸的含量高達(dá)73.7%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于蜘蛛拖牽絲，其LC∶SC比值遠(yuǎn)比蜘蛛絲小。小側(cè)基氨基酸有利于結(jié)晶的形成，因此，計(jì)算LC∶SC比值的方法已被應(yīng)用于預(yù)測(cè)絲蛋白結(jié)晶區(qū)與無(wú)定型區(qū)的相對(duì)含量[48]。根據(jù)這一方法，可預(yù)知卵袋絲（柱狀腺絲）比拖牽絲和卵袋框絲含有更多的無(wú)定型區(qū)。此外，本文研究的悅目金蛛和棒絡(luò)新婦卵袋框絲的LC∶SC比值分別為0.79和0.85（表3），比Casem等[34]報(bào)道的L.hesperus圓網(wǎng)框絲的0.37要大，表明了不同種類蜘蛛的大壺狀腺絲氨基酸組成和蛋白結(jié)構(gòu)的多樣性。雖然卵袋框絲與拖牽絲氨基酸組成相似，但卵袋框絲中小側(cè)基氨基酸的含量較拖牽絲少而極性氨基酸的含量高于拖牽絲，脯氨酸的含量也比拖牽絲低。分子生物學(xué)的研究[10,22,41]表明，絡(luò)新婦蛛（Nephila clavipes）大壺狀腺至少含有兩種上皮細(xì)胞，分別分泌MaSp1與MaSp2這兩種絲心蛋白家族成員，MaSp1不含有脯氨酸，MaSp2富含脯氨酸。當(dāng)MaSp2流經(jīng)膨大區(qū)時(shí)，MaSp1分泌出來(lái)與MaSp2以不同比例混合，再流經(jīng)導(dǎo)管至紡管最后紡出[49]。因此，從脯氨酸的含量來(lái)看，棒絡(luò)新婦卵袋框絲比拖牽絲含有較多的MaSp1。而十字園蛛（Araneus diadematus）的MaSp1與MaSp2都富含脯氨酸，因此與十字園蛛親緣關(guān)系較近的悅目金蛛的拖牽絲比卵袋框絲可能含有較多低含量脯氨酸的其它絲心蛋白。

3.3 紅外光譜分析

酰胺Ⅰ（約1,650 cm－1）和Ⅱ（約1,540 cm－1）的峰通常被認(rèn)為是無(wú)序結(jié)構(gòu)的貢獻(xiàn)，表明可能含有自由卷曲結(jié)構(gòu)和/或α-螺旋，這些結(jié)構(gòu)形成無(wú)定型區(qū)，這種非結(jié)晶結(jié)構(gòu)賦予絲纖維的延展性；而酰胺Ⅱ（約1,520 cm－1）和酰胺Ⅲ（約1,230 cm－1）的峰則被認(rèn)為與β-折疊有關(guān)，而1,690 cm－1附近的吸收峰可能是與β-折疊結(jié)構(gòu)有關(guān)的β-轉(zhuǎn)角（β-turn）或β-彎曲（β-bend）的吸收峰，這些結(jié)構(gòu)形成結(jié)晶區(qū)，這種結(jié)晶結(jié)構(gòu)賦予絲纖維的高模量和高強(qiáng)力[50,51]。另外，β折疊分子的酰胺Ⅴ特征譜帶[17]約在700 cm－1處，而α-螺旋分子的酰胺Ⅴ特征譜帶約在600 cm－1。

表3悅目金蛛和棒絡(luò)新婦卵袋絲與拖牽絲蛋白氨基酸種類分析(摩爾%) T a b le 3 A n a lysis o f th e va rio u s c la sse s o f a m in o a cid R -g ro u p s a s so cia te d w ith th e e g g ca se s注：極性氨基酸：天門冬氨酸+蘇氨酸+絲氨酸+谷氨酸+酪氨酸+賴氨酸+組氨酸+精氨酸；酸性氨酸+精氨酸；小側(cè)鏈氨基酸：甘氨酸+丙氨酸+絲氨酸*數(shù)數(shù)據(jù)引自王昌河等(2006)[43]據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理均使用SP SS 13.0軟件完成，采用on e-way-AN OV A分析。n為蜘蛛個(gè)體數(shù)N o te: p olar residues: asp + thr + ser+ glu + tyr+ lys+ his+ arg; acidic resid ues: asp+ glu B asic resid ues: lys+ his; S ho rt ch ain: gly+ ala+ ser. *T he data w ere cited fro m W an g et al (200 6) [43] T h e d ata w ere analyzed w ith O ne-w ay-A N O V A procedu re from spss13 .0 . n is the nu m ber of the p id ers S ilk P olar A cid ic B asic residue R e N . clavata D ragline (n = 3 ) 3 1.8± 0.5 1 8.4± 0.6 2 .1± 0.1 3 9.8 3 8.9± 0.2 19.3± 0.1 2 .8± 0.0 46.0 49.3± 0.4 16.9± 0.1 1 .4± 0.0 50.8 31.0± 0.5 17.8± 0.2 5 .2± 0.0 38.9 B om byx m ori S ilkw orm silk * 27 .9 2.98 0.66 2 A . am oena D ragline (n = 3) 36.4± 0.4 31.0± 0.3 50.4± 0.5 5 6.± 0.4 16.2± 0.2 13.4± 0.1 15.1± 0.2 18.7± 0.2 2 .4± 0.0 6 .6± 0.1 2 .9± 0.0 3 .8± 0.1 46.2 44.2 48.8 51.3 S caffo lding silk (n = 4) In ner co ver silk (n = 4 ) O uter cover silk (n = 4) S caffo lding silk (n = 4) In ner co ver silk (n = 4 ) O uter cover silk (n = 4) E gg case E gg csase

日本豐橋大學(xué)的Yasumasa Fukushima[50]設(shè)計(jì)了以X-Gly-Gly（X分別為Ala，Ty，Gln和Leu）為基序的4個(gè)肽鏈分子，作為蜘蛛拖牽絲富含Gly序列的模型。4種聚合分子的紅外光譜研究表明，隨著分子中β折疊含量的增加poly（Leu-Gly-Gly）＜poly（Ala-Gly-Gly）＜poly（Gln-Gly-Gly）＝poly（Tyr-Gly-Gly），在波譜數(shù)約為1,695、1,520和1,626 cm－1處的吸收峰也隨之增強(qiáng)；隨著分子中無(wú)序結(jié)構(gòu)的增加，酰胺Ⅰ（約1,650 cm－1）和酰胺Ⅱ（約1,540 cm－1）的吸收峰增加。以此為依據(jù)，悅目金蛛和棒絡(luò)新婦袋框絲及棒絡(luò)新婦拖牽絲（圖3和5）均是由大壺狀腺放出的，都有較強(qiáng)的多聚丙氨酸（polyA）吸收峰（約960 cm－1），在1,695 cm－1處均出現(xiàn)了吸收小峰，這表明它們具有相似的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，含有較多的β折疊和/或其它有序結(jié)構(gòu)，如與β-折疊結(jié)構(gòu)有關(guān)的β-轉(zhuǎn)角（β-turn）或β-彎曲（β-bend）[51]，以適應(yīng)其高強(qiáng)力和高模量的功能要求，為卵袋提供了很好的固定與支持[37,39]。與卵袋框絲和拖牽絲相比，主要由柱狀腺絲組成的卵袋覆蓋層的多聚丙氨酸（polyA）吸收峰（約960 cm－1）很弱（圖4），這表明其含有較多的自由卷曲結(jié)構(gòu)和/或α-螺旋等無(wú)序結(jié)構(gòu)，但在約1,695 cm－1處均不同程度地出現(xiàn)了吸收小峰；悅目金蛛卵袋內(nèi)層絲與灰綠色外層絲還在1,626 cm－1處有吸收小峰；這又表明它們結(jié)構(gòu)的有序性似乎也不差。與棒絡(luò)新婦卵袋框絲和拖牽絲相比，棒絡(luò)新婦的卵袋內(nèi)層絲與悅目金蛛淺棕色外覆蓋層絲在1,540 cm－1左右有明顯的吸收小峰，這可能是卵袋覆蓋層中葡萄狀腺絲或梨狀腺絲的貢獻(xiàn)[33,47]。悅目金蛛人工抽拖牽絲的多聚丙氨酸（polyA）吸收峰（約960 cm－1）較弱，而在1,540與1,626 cm－1處出現(xiàn)了小峰，表明抽絲的條件對(duì)其蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)有重要影響。

Tian等[27]對(duì)金蛛（Argiope aurantia）和絡(luò)新婦屬蜘蛛（N.clavipes）的柱狀腺絲蛋白的分子生物學(xué)研究表明，柱狀腺絲主要成分絲心蛋白TuSp1含有Sn、（SA）n、（SQ）n和GX氨基酸基序，而幾乎不含有大壺狀腺絲所具有的An、（GA）n或（GPGXX）n、(GGX）n等基序。此外，雖然柱狀腺絲蛋白ADF-2主要含有An和（GGX）n基序[23]，但柱狀腺絲氨基酸組成與其基序不符合，表明它是一種表達(dá)量很低的蛋白。本文中，悅目金蛛和棒絡(luò)新婦的主要由柱狀腺絲構(gòu)成的卵袋覆蓋層絲的酰胺Ⅲ（約1,230 cm－1）特征帶的吸收峰強(qiáng)度都降低了，而且多聚丙氨酸（polyA）的吸收峰（約960 cm－1）都很弱，表明柱狀腺絲幾乎不含有紡自大壺狀腺的拖牽絲和卵袋框絲所具有的poly-Ala基序，非結(jié)晶結(jié)構(gòu)含量較豐富，β-折疊結(jié)構(gòu)的含量也降低，這與前面預(yù)測(cè)結(jié)果一致。此外，柱狀腺絲的絲氨酸的含量有較大幅度的增加，而甘氨酸的含量同時(shí)大幅度減少（表1），脯氨酸的含量也很少，從而在化學(xué)結(jié)構(gòu)表征上支持了上述分子生物學(xué)的研究結(jié)果。

3.4 卵袋絲力學(xué)性能

影響絲纖維力學(xué)性能的因素主要有兩方面：1）絲纖維的結(jié)構(gòu)，包括分子間/內(nèi)的結(jié)構(gòu)[38]。谷氨酸和脯氨酸對(duì)分子結(jié)構(gòu)有重要作用。谷氨酸為酸性氨基酸，其側(cè)基上的氨基和羧基使分子間的鍵合作用加強(qiáng)，而脯氨酸的存在將有利于分子鏈形成類似于β-轉(zhuǎn)角的彈性螺旋狀結(jié)構(gòu)，使纖維的彈性增大[52]。大側(cè)基氨基酸含量增加，會(huì)導(dǎo)致蛛絲結(jié)晶度下降；極性氨基酸含量增加，會(huì)導(dǎo)致分子間的作用力增強(qiáng)。由于卵袋內(nèi)層絲含有比大壺狀腺絲較多的大側(cè)鏈氨基酸，而Pro的含量很少，因而在悅目金蛛和棒絡(luò)新婦卵袋內(nèi)層絲中，呈類似于β-轉(zhuǎn)角的彈性螺旋狀結(jié)構(gòu)可能很少。雖然卵袋內(nèi)層絲小側(cè)基氨基酸含量少，幾乎不含有poly-Ala基序，β-折疊結(jié)構(gòu)的含量也降低，不利于結(jié)晶的形成，結(jié)晶度降低，非結(jié)晶結(jié)構(gòu)含量較豐富，但大量的極性氨基酸使分子間的作用力增大。因此，從表2的力學(xué)性能參數(shù)可以看出，卵袋內(nèi)層絲（特別是悅目金蛛卵袋內(nèi)層絲）表現(xiàn)出良好的延展性、斷裂強(qiáng)度和斷裂能，屈服點(diǎn)也較高，增加了彈性形變區(qū)的投入，其力學(xué)性能并不遜色于卵袋框絲與拖牽絲。2）絲纖維的尺寸大小，即尺寸效應(yīng)[38]。卵袋框絲直徑變化大，且含有除大壺狀腺絲以外的其它類型的細(xì)絲纖維，拉伸行為變化也較大，其單絲的拉伸行為的重復(fù)性較差，這表明蜘蛛除了能通過(guò)改變蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，還能通過(guò)改變直徑來(lái)調(diào)節(jié)絲纖維的力學(xué)性能，以適應(yīng)卵袋所處的異質(zhì)環(huán)境；而卵袋內(nèi)層絲均為單絲纖維，且直徑變化較小，其拉伸行為也表現(xiàn)出良好的重復(fù)性，這表明蜘蛛能通過(guò)某種機(jī)制來(lái)精確控制絲纖維的分子結(jié)構(gòu)，以使其力學(xué)性能具有良好的重復(fù)性，適應(yīng)卵塊所處的同質(zhì)穩(wěn)定的微環(huán)境。

4 結(jié)論

紡自大壺狀腺的拖牽絲和卵袋框絲的大側(cè)鏈氨基酸含量低，甘氨酸和脯氨酸含量高，極性氨基酸和絲氨酸含量低，LC與SC比值小，多聚丙氨酸吸收峰較強(qiáng)，含有較多的β折疊和/或其它有序結(jié)構(gòu)，結(jié)晶結(jié)構(gòu)含量較豐富，以適應(yīng)其高強(qiáng)力和高模量的功能要求，為卵袋提供了很好的固定與支持；而主要由柱狀腺絲構(gòu)成的卵袋覆蓋層絲的大側(cè)鏈氨基酸含量高，甘氨酸含量較低，脯氨酸的含量很低，極性氨基酸和絲氨酸含量較高，LC∶SC的值較高，多聚丙氨酸吸收峰很弱，β-折疊結(jié)構(gòu)的含量降低，非結(jié)晶結(jié)構(gòu)含量較豐富，滿足其高延展性、高斷裂能和較高強(qiáng)力的功能要求，為卵塊或若蛛營(yíng)造了穩(wěn)定的微環(huán)境和安全的庇護(hù)所。因此，柱狀腺絲是一種具有與大壺狀腺絲完全不同的物理化學(xué)結(jié)構(gòu)表征與力學(xué)性能的新型蛛絲纖維。

致謝：感謝四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心氨基酸分析室的胡繼楫研究員和羅曉梅老師。感謝四川大學(xué)分析測(cè)試中心紅外光譜室的祝曉紅老師和電鏡室的王輝老師。感謝四川大學(xué)高分子科學(xué)與工程學(xué)院化纖研究所所長(zhǎng)葉光斗教授、李守群高級(jí)工程師、劉曉慧老師對(duì)本研究提供的幫助。

1.Gosline J,Denny M,DeMont M.Spider silk as rubber. Nature,1984,309:551～552

2.Vollrath F.Spider webs and silk.Science,1992,266: 70～76

3.Hinman MB,StaufferSL,LewisRV.Mechanicaland chemical properties of certain spider silks.In:Kaplan D, Adams WW et al,Eds.Silk Polymers.Materials Science andBiotechnology.Washington:AmericanChemical Society,1994.222～233

4.Mahoney DV,Vezie DL,Eby RK,Adams WW,Kaplan D. Aspects of the morphology of dragline ofNephila clavipes. Materials Science and biotechnology,1994,544:196～210

5.Vollrath F,Holtet T,Thogersen H,Frische S.Structural organization of spider silk.Proc R Soc Lond,1996,263: 147～151

6.Frische S,Maunsbach AB,Vollrath F.Elongate cavities and skin-core structure inNephilaspider silk observed by electron microscopy.Journal of Microscopy,1998,189: 64～70

7.Miller L,Putthanarat S,Eby R,Adams W.Investigation of the nanofibrillar morphology in silk fibers by small angle X-ray scattering and atomic force microscopy.Int J Biol Macromol,1999,24:159～165

8.Putthanarat S,Eby RK.Aspects of the morphology of the silk of bombyx mori.J Macromol Sci Pure Appl Chem, 1996,A33:899～911

9.Robson RM.Microvoids in Bombyx mori silk.An electron microscopestudy.InternationalJournalofBiological Macromolecules,1999,24:145～150

10.Himan MB,Jones J A,Lewis RV.Synthetic spider silk:a modular fiber.TIBTECH,2000,18:374～379

11.Dong Z,Lewis RV,Middaugh CR.Molecular mechanisms of spider silk elasticity.Arch Biochem Biophys,1991,284: 53～57

12.Bram A,Branden CI,Craig C,Snigireva I,Riekel C.X-ray diffraction from single fibres of spider silk.J Appl Cryst, 1997,30:390～392

14.Valluzzi R,Jin HJ.X-ray evidence for a"super"-secondary structureinsilkfibers.Biomacromolecules,2004,5: 696～703

15.Shao ZZ,Vollrath F,Sirichaisit J,Young RJ.Analysis of spidersilkinnativeandsupercontractedstatesusing Raman spectroscopy.Polymer,1999,40:2493～2500

16.Sirichaisit J,Young RJ,Vollrath F.Molecular deformation in spider dragline silk subjected to stress.Polymers,1999, 41:1223～1227

17.Sirichaisit J,Brookes VL,Young RJ,Vollrath F.Analysis of structure/property relationships in silkworm(Bombyx mori) and spider dragline(Nephila edulis)silks using Raman spectroscopy.Biomacromolecules,2003,387(4):387～394

18.Beek JV,Kümmerlen D,Vollrath F,Meier BH.Solid state NMR on supercontracted spider dragline silk.Int J Biol Macromol,1999,24:173～178

19.Simmons A,Ray E,Jelinski LW.Solid state 13C NMR of N.cla6ipes dragline silk establishes structure and identity of crystalline regions.Macromolecules,1994,27:5235～ 5237

20.Simmons A,Michal C,Jelinski L.Molecular orientation and two-component nature of the crystalline fraction of spider dragline silk.Science,1996,271:84～87

21.Eles PT,Michal CA.A decoder NMR study of backbone orientation inNephila clavipesdragline silk under varying strain and draw rate.Biomacromolecules,2004,5:661～665

22.Hayashi CY,Shipley NH,Lewis RV.Hypotheses that correlatethesequence,structure,andmechanical properties of spider silk proteins.Int J Biol Macromol, 1999,24:271～275

23.Vollrath F.Strength and structure of spider'silks.Biological Macromolecules,2000,74:67～83

24.Vollrath F,Knight DP.Liquid crystalline spinning of spider silk.Nature,2001,410:541～548

25.尹長(zhǎng)民(主編）.中國(guó)動(dòng)物志(蛛形綱:蜘蛛目:園蛛科).北京:科學(xué)出版社,1997 Yin CM（Eds）.FaunaSinica:Araneidae.Beijing:Science Press,1997

26.蔣平,卓春暉,楊文博,郭聰.棒絡(luò)新婦和悅目金蛛絲腺形態(tài)初步觀察.蛛形學(xué)報(bào),2006,15(2):90～97 Jiang P,Zhuo CH,Yang WB Zhuo CH,Guo C.Primary study on the morphologies of spiderNephila clavataand Argiope amoena silk glands.Acta Arachnologica Sinica, 2006,15(2):90～97

27.Tian M,Lewis RV.Tubuliform silk protein:a protein with unique molecular characteristics and mechanical properties in the spider silk fibroin family.Appl Phys A,2006,82: 265～273

28.Garb JE,Cheryl YH.Modular evolution of egg case silk genesacrossorb-weavingspidersuperfamilies.PNAS, 2005,102(32):11379～11384

29.BarghoutJYJ,ThielBL,VineyC.Spider(Araneus diadematus)cocoon silk:a case of non-periodic lattice crystals with a twist?International Journal ofBiological Macromolecules,1999,24:211～217

30.BarghoutJYJ,CzernuszkaJT,VineyC.Multiaxial anisotropyofspider(Araneusdiadematus)cocoonsilk fibres.Polymer,2001,42:5797～5800

31.Hayashi CY,Lewis RV.Evidence from flagelliform silk cDNA for the structural basis ofelasticity and modular nature of spider silks.J Mol Biol,1998,275:773～784

32.Guerette PA,Ginzinger DG,Weber BH,Gosline JM.Silk propertiesdeterminedbygland-specificexpressionofa spider fibroin gene family.Science,1996,272:112～115

33.Hayashi CY,Blackledge TA,Lewis RV.Molecular andmechanical characterization of aciniform silk:uniformity of iteratedsequencemodulesinanovelmemberofthe spider silk fibroin gene family.Mol Biol Evol,2004,21(10): 1950～1959

34.Casem ML,Turner D,Houchin K.Protein and amino acid compositionofsilksfromthecobweaver,Latrodectus hesperus(black widow).International Journal of Biological Macromolecules,1999,24:103～108

35.Foradori MJ,Kovoor J,Moon MJ,Tillinghast EK.Relation betweentheoutercoveroftheeggcaseofArgiope aurantia(Araneae:Araneidae)and the emergence of its spiderlings.Jounal of Morphology,2002,252:218～226

36.潘志娟,李春萍,劉敏,盛家鏞.李棟高.大腹園蛛包卵絲的化學(xué)組成與物理機(jī)械性能.東華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2002, 28(4):34～39 Pan ZJ,Li CP,Liu M,Sheng JY,Li DG.Amino acid composition and physical mechanical properties ofAraneus ventricosusspideregg-casesilk.JournalofDonghua University,Natural Science,2002,28(4):34～39

37.蔣平,肖永紅,周兵,廖信軍,郭聰.悅目金蛛卵袋結(jié)構(gòu)與組成.動(dòng)物學(xué)報(bào),2008,54(5):918～927 Jiang P,Xiao Y.H,Zhou B,Liao XJ,Guo C.Structure and compositionofthespiderArgiopeamoenaeggcase. China Acta zoology,2008,54(5):918～927

38.Jiang P,Liu HF,Wang CH,Huang JG,Wu LZ,Guo C. Tensile behavior and morphology of differently degummed silkworm cocoon silk fibres.Materials letters,2006,(60): 919～925

39.蔣平,沈麗,楊孔,冉丹,郭聰.三種類型蜘蛛絲的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能.動(dòng)物學(xué)雜志，2003,38(5):10～14 Jiang P,Shen L,Yang K,Ran D,Guo C.Structure and biological function of three types of spider silk.Chinese Journal of Zoology,2003,38(5):10～14

40.Pe'rez-Rigueiro J,Elices M,Llorca J,Viney C.Tensile properties ofArgiope trifasciatadrag line silk obtained from the spider's web.Journal ofApplied Polymer Science, 2001,82:2245～2251

41.Gosline JM,Guerette PA.The mechanical design of spider silk:from fibroin sequence to mechanical function.Journal of Experimental Biology,1999,202:3295～3303

42.Pe'rez-Rigueiro J,Elices M,Llorca J,Viney C.Effect of degumming on the tensile properties of silkworm(Bombyx mori)silk fiber.Journal of Applied Polymer Science,2002, 84:1431～1437

43.王昌河,蔣平,劉輝芬,吳靈芝,郭聰.轉(zhuǎn)蜘蛛拖牽絲蛋白基因家蠶蠶絲氨基酸組成及其機(jī)械性能.四川動(dòng)物,2006,25: 451～454 Wang CH,Jiang P,Liu HF,Wu LZ,Guo C.Amino acid compositionandtensilepropertiesofcocoonsilkfrom transgenic silkworm(Bombyx mori)with synthetic MaSpI gene.Sichuan Journal of Zoology,2006,25:451～454

44.潘志娟,朱美男.原子力顯微鏡下蠶絲及蜘蛛絲的微觀結(jié)構(gòu).材料科學(xué)與工程學(xué)報(bào),2005,23(3):365～368 Pan ZJ,Zhu MN.Microstructures of bombyx mori silk and spider silk revealed by atomic force microscopy.Journal of Materials Science&Engineering,2005,23(3):365～368

45.Blackledge TA,Hayashi CY.Silken toolkits:biomechanics of silk fibers spun by the orb web spiderArgiope argentata (Fabricius 1775).Journal of Experimental Biology,2006, (209):2452～2461

46.Gheysens T,Beladjal L,Gellynck K,van Nimmen E,van Langenhove L,Mertens J.Egg sac structure ofZygiella x-notata(arachnid,araneid).The Journal of Arachnology, 2005,33:549～557

47.Vasanthavada K,Hu X,Falick AM,La Mattina C,Moore AM,Jones PR,Yee R,Reza R,Tuton T,Vierra C. Aciniform spidroin,a constituent of egg case sacs and wrappingsilkfibersfromtheblackwidowspider Latrodectus hesperus.J Biol Chem,2007,30,282(48): 35088～35097

48.Lombardi SJ,Kaplan DL.The amino acid composition of major ampullate gland silk(dragline)ofNephilacla6ipes (Araneae,Tetragnathidae).J Arachnol,1990,18:297～306

49.Dicko C,Vollrath F,Kenney JM.Spider silk protein refolding is controlled by changing pH.Biomacromolecules, 2004,5:704～710

50.Fukushima Y.Secondary structural analysis in the solid state for analogous sequential polypeptides of glycine-rich sequence of spider dragline silk.Polymer Bulletin,2000, 45:237～244

51.周文,陳新,邵正中.紅外和拉曼光譜用于對(duì)絲蛋白構(gòu)象的研究.化學(xué)進(jìn)展,2006,18(11):1514～1522 Zhou W,Chen X,Shao ZZ.Conformation studies of silk proteins with infrared and Raman spectroscopy.Progress In Chemistry,2006,18(11):1514～1522

52.Savage KN,Gosline JM.The effect of proline on the network structure of major ampullate silks as inferred from their mechanical and optical properties.The Journal of Experimental Biology,2008,211:1937～1947

Abstract：Spider silk is the result of 400 million years of evolution and an attractive natural animal protein fibers for its excellent mechanical properties.The biological function and spider life history have shaped the silk structures and mechanical properties.Here the authors examined the egg case silks from the orb web spider,Argiope amoenaandNephila clavataby the automatic amino acid analyzer,SEM,FTIR and electric single-fiber tensile apparatus with the goal of expanding our understanding of the relationship between the structure,mechanical performance and biological function of these unique biomaterials.The results indicated that the egg case of these two spiders was composed of the micron-sized cylindrical and major ampullate silk and submicron-sized or nanoscale aciniform silk.The physical(e.g.diameter,morphologies),amino acid composition(e.g.polar,glycine,serine,proline,large and small side chains amino acid)and secondary structure(e.g.β-sheet crystalline,amorphous domains)characteristics of egg case silk all matched to the mechanical(e.g.break strength,extensibility,initial modulus)requirements for their biological or ecological functions respectively.

Key Words：Spider;Egg case silk;Physico-chemical structure;Mechanical properties

Physico-Chemical Structural Characterizations and Mechanical Properties of Egg Case Silk from The Two Spiders:Argiope amoena andNephila clavata

JIANG Ping1,LV Taiyong1,XIAO Yonghong1,ZENG Jianzhong1, ZHOU Bing1,GUO Cong2

1 College of Life Sciences,Jinggangshan University,Ji'an,Jiangxi 343009,China；

2 Key Laboratory of Bio-resources and Eco-environment,Ministry of Education,College of Life Sciences, Sichuan University,Chengdu 610064,China

Q957，Q956

2009-08-14；接受日期：2010-01-04

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30760041)；江西省教育廳科技項(xiàng)目(GJJ08422，GJJ08423)；江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2007GQN1690)

蔣平，電話：(0796)8100493，E-mail：jping412@yahoo.com.cn

Thisworkwassupportedby grantsfromTheNationalNaturalScienceFoundationofChina(30760041),TheEducation Department of Jiangxi province(GJJ08422,GJJ08423)and The Natural Science Foundation of Jiangxi province(2007GQN1690)

Received:Aug 14,2009Accepted:Jan 4,2010

Corresponding author:JIANG Ping,Tel:+86(796)8100493,E-mail:jping412@yahoo.com.cn