圍產期食物限制對子代成年大鼠海馬CA1區(qū)突觸可塑性的影響

張引國,李寧,楊佳佳,張濤,楊卓

1.南開大學生命科學學院，生物活性材料教育部重點實驗室，天津300071;

2.南開大學醫(yī)學院，天津300071

圍產期食物限制對子代成年大鼠海馬CA1區(qū)突觸可塑性的影響

張引國1,李寧2,楊佳佳1,張濤1,楊卓2

1.南開大學生命科學學院，生物活性材料教育部重點實驗室，天津300071;

2.南開大學醫(yī)學院，天津300071

圍產期食物限制導致子代大鼠學習和記憶能力等的神經生物學變化，但其機制并不清楚。將成年Wistar雌性大鼠與雄性大鼠同籠，受孕后隨機分為對照組(n=9)和食物限制組(n=8)。對照組母鼠在妊娠期和哺乳期自由進食和飲水，食物限制組母鼠從妊娠的第7天到子代大鼠出生后21天進行食物限制，食物限制量為對照組大鼠的50%。子代雄性大鼠成年后，通過Morris水迷宮測試空間學習和記憶能力。之后，在海馬CA1區(qū)在體記錄場興奮性突觸后電位(field excitatory postsynaptic potential，fEPSP)，并采用免疫組織化學方法觀察海馬CA1區(qū)神經元型一氧化氮合酶(nNOS)陽性細胞密度的變化。結果表明，圍產期食物限制降低了子代大鼠出生后第1、7、10、14和21天的體重，并減弱了成年子代大鼠的學習和記憶能力，海馬CA1區(qū)fEPSP的斜率和nNOS陽性細胞的密度也明顯降低。結果提示，圍產期食物限制可能通過抑制NO的產生降低了海馬突觸可塑性，從而影響了子代大鼠的學習和記憶能力。

海馬；學習和記憶；長時程增強；一氧化氮；食物限制；圍產期

0 引言

成年和老年食物限制可以產生許多有益的生物學效應，包括延長生命周期[1,2]、延緩衰老和疾病的進程[3,4]、提高學習和記憶能力[5,6]及降低藥物毒性等。然而，圍產期食物限制可導致胎兒宮內發(fā)育受限（intrauterine growth restriction,IUGR），主要表現(xiàn)為動物出生后體重降低、生長緩慢、神經發(fā)育延遲[7,8]，以及成年社會行為[9]和空間學習能力下降[10]等。

在中樞神經系統(tǒng)中，海馬屬邊緣系統(tǒng)，與學習和記憶能力密切相關。有證據表明，海馬CA1區(qū)對于空間信息的獲得、鞏固和存儲是必需的[11,12]。長時程增強（long-term potentiation，LTP）是中樞神經系統(tǒng)重要的可塑性形式，一直被認為是學習與記憶的神經基礎之一[13]。LTP作為衡量海馬神經突觸可塑性的重要指標，己被廣泛應用。

海馬CA1區(qū)LTP的誘導和維持需要興奮性神經遞質谷氨酸的釋放。一氧化氮(nitric oxide，NO)作為一種逆向信使，促進突觸前神經元谷氨酸的釋放，從而易化了在突觸后神經元上記錄的LTP[14]。

本研究采用Morris水迷宮測試和電生理實驗方法,分別觀察圍產期食物限制對子代成年大鼠學習與記憶能力和海馬CA1區(qū)LTP的影響，并進一步用免疫組化方法觀察海馬CA1區(qū)神經元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)陽性細胞的密度,以期從突觸可塑性的角度研究圍產期食物限制影響子代空間學習和記憶能力的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

健康成年13周齡Wistar大鼠,購于軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心。動物適應3天后，將雌鼠與雄鼠同籠(雌雄比為2～3∶1)飼養(yǎng)。之后，每日早晨檢查雌鼠陰道口或陰道涂片，若發(fā)現(xiàn)陰道栓或涂片中有大量的精子存在，則記為大鼠妊娠第0天(gestation day 0，E0)。稱其體重，分籠喂養(yǎng)。此后于妊娠的E7、E14和E21測定孕鼠體重，妊娠期共測4次體重。

1.2 分組及模型制備

妊娠大鼠隨機分為對照組(n=9)和食物限制組(n=8)。對照組自由攝食，并記錄每日飼料消耗量。食物限制組從妊娠的E0到E6自由攝食，從妊娠的E7到仔鼠出生的21天(postnatal day 21，PD21)進行食物限制，食物限制量為對照組大鼠每日平均飼料消耗量的50%[7]。兩組孕鼠均予充足飲水。大鼠自然分娩的當天記為仔鼠出生的PD0，分別于仔鼠出生的PD1、PD7、PD10、PD14和PD21稱重。

1.3 空間學習與記憶能力測試

子代大鼠成年(PD70)后進行水迷宮行為學實驗。Morris水迷宮裝置為一直徑150 cm、高60 cm的圓形水池。水溫保持在(24±1)℃。將水池等分為東、南、西、北四個象限，以其中一個象限作為目標象限，在其正中放有一個直徑10 cm的圓形平臺，平臺低于水面2 cm。將安裝好的攝像裝置與計算機連接，大鼠的運動軌跡及測試結果均顯示在計算機上。訓練期間水迷宮外參照物保持不變，即視覺線索保持不變。Morris水迷宮的測試包括定位航行(place navigation test)和空間探索(probe trial performance)兩個實驗。定位航行實驗歷時5天，每天分上、下午兩個時間段訓練。在每個時間段訓練4次，分別從4個坐標象限的中點將大鼠面向池壁放入水中，記錄大鼠找到平臺的時間，即逃避潛伏期(escape latency)。若在120 s內找不到平臺，則將大鼠引導到平臺上并保持15 s。每次訓練結束后擦干大鼠身體，放入各自的鼠籠內并適當給予保暖。第6天撤除平臺作空間探索實驗，選與平臺象限相對象限的中點為入水點，將大鼠放入水中，記錄120 s內大鼠跨越平臺的次數及在目標象限的搜索時間百分比。

1.4 海馬CA1區(qū)LTP記錄

大鼠腹腔注射戊巴必妥鈉（50 mg/kg）麻醉后，固定于立體定位儀上，用電熱毯保溫。記錄電極和刺激電極均用直徑75 μm的不銹鋼絕緣絲制成，尖端裸露。單極記錄電極垂直插入海馬CA1區(qū)錐體細胞樹突叢（前囟后3.4 mm，中線旁開2.5 mm)，雙極刺激電極插入同側海馬Schaffer側枝（前囟后4.2 mm，中線旁開3.5 mm）[15]。調整記錄電極和刺激電極的深度，直至記錄到最大場興奮性突觸后電位（覱eld excitatory postsynaptic potential，fEPSP）為止。

以波寬0.2 ms、頻率0.033 Hz的測試刺激，作用于大鼠海馬CA3區(qū)Schaffer側枝，誘導海馬CA1區(qū)錐體細胞樹突叢fEPSP。以fEPSP幅度的50%的電流強度作為最適刺激強度。記錄30 min fEPSP后進行高頻刺激。高頻刺激由10串200 Hz的方波組成，串間隔2 s。之后，用相同的波寬（頻率0.033 Hz）記錄120 min fEPSP。用Clampfit 9.0軟件分析fEPSP的斜率。

1.5 nNOS免疫組織化學檢測

大鼠經左心室先后灌入0.9%生理鹽水和含4%多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.4）固定液，取出全腦，入上述固定液中后固定。連續(xù)冠狀切片（厚50 μm）。采用鏈霉親合素-生物素-過氧化物酶復合物（ABC）法進行免疫組織化學染色。切片移入37℃0.3%H2O2和1%Triton X-100中孵育30 min，磷酸緩沖液漂洗后，以5%的羊血清封閉30 min，然后加nNOS抗體（1∶200，Santa Cruz公司），4℃溫盒內孵育72 h。磷酸緩沖液漂洗后加生物素標記的兔抗羊血清（1∶200），于37℃孵育1 h，ABC液（1∶100，Vector公司）37℃孵育1 h。之后用0.5 ml/L的DAB顯色。鏡下控制反應時間5～10 min。常規(guī)裱片，脫水，透明，封片。置光學顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)nNOS陽性神經元密度。

1.6 統(tǒng)計學分析

所有數值用平均數±標準誤（M±SEM）表示。采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析。體重和逃避潛伏期采用重復方差分析，其它（跨越平臺的次數、在目標象限的搜索時間、游泳速度、fEPSP斜率及nNOS陽性神經元密度）采用t檢驗。fEPSP斜率表示為基準值的百分比（基準值為高頻刺激前30 min fEPSP斜率的平均值）。P＜0.05被認為有顯著性差異。

2 結果

2.1 圍產期食物限制對孕鼠和子代大鼠體重的影響

由表1可知，食物限制組孕鼠在E1和E7的體重與對照組無明顯差異，但在E14和E21呈負增長，與對照組有顯著性差異。這顯然與食物攝入限制開始時間密切相關。另外，食物限制組子代大鼠在PD1、PD7、PD10、PD14和PD21的體重也明顯小于對照組（表2）。

表1 圍產期食物限制(FR50)對孕鼠體重(克)的影響Table 1Effect of perinatal food restriction(FR50)on body weight(g)of dam

表2 圍產期食物限制(FR50)對仔鼠體重(克)的影響Table 2Effect of perinatal food restriction(FR50)on mean pup body weights(g)

2.2 圍產期食物限制對子代成年大鼠水迷宮學習與記憶行為的影響

實驗在對照組雄性子代大鼠（n=9）和食物限制組雄性子代大鼠（n=8）上進行。大鼠經連續(xù)5天訓練，無論是對照組還是食物限制組子代大鼠，其逃避潛伏期均呈縮短趨勢（圖1），這一現(xiàn)象表明大鼠空間學習能力隨訓練次數增加而有所增強。食物限制組子代大鼠的逃避潛伏期在訓練的第2、3、4和5天均明顯大于對照組，表明圍產期食物限制明顯減弱子代大鼠的空間學習能力。

為進一步觀察圍產期食物限制對子代大鼠記憶能力的影響，檢測了大鼠跨越平臺的次數及在目標象限的搜索時間百分比。二者均反映大鼠對平臺所在位置的記憶保持能力。正常組子代大鼠跨越平臺（6.3±0.75）次，而食物限制組跨越平臺（4.2±0.41）次，兩者有顯著差異（P＜0.05）（圖2）。正常組子代大鼠在目標象限的搜索時間百分數為44.6%±2.1%，而食物限制組在目標象限的搜索時間百分數為36.2%±2.5%，顯然兩者差異明顯（P＜0.01）（圖3）。結果表明圍產期食物限制對子代大鼠空間記憶能力也有顯著的抑制作用。

兩組大鼠6天的平均游泳速度無明顯差異，表明子代大鼠學習和記憶能力的變化并非運動能力差異及其它非特異性因素造成的（圖4）。

圖1 定位航行中的平均逃避潛伏期圍產期食物限制(FR50)引起成年子代大鼠在訓練的第2(P＜0.05)、3(P＜0.01)、4(P＜0.01)和5天(P＜0.05)需較長的時間到達隱蔽平臺。在訓練的第1天到達平臺的時間與對照組相比無明顯差異。*P＜0.05，**P＜0.01，食物限制組與對照組比較Fig.1Mean escape latency in place navigationPerinatal food restriction(FR50)caused adult offspring rats to spend longer time(second)to escape onto a hidden platform on training day 2(P＜0.05),day 3(P＜0.01),day 4(P＜0.01)and day 5(P＜0.05).There was no difference on training day 1 compared with the control group,*P＜0.05,**P＜0.01,FR50 group vs.control group

圖2 空間探索中目標象限的平均搜索時間百分比圍產期食物限制(FR50)子代大鼠在目標象限明顯停留較少的時間。**P＜0.01，食物限制組與對照組比較Fig.2Mean percent of time spent in the target quadrant in spatial probeThe offspring rats in perinatal food restriction(FR50)rats spent significantly less time in target quadrant,**P＜0.01,FR50 group vs.control group

圖3 空間探索中跨越平臺位置的次數圍產期食物限制(FR50)子代大鼠與對照組相比跨越平臺位置的次數較少。*P＜0.05，食物限制組與對照組比較Fig.3The mean of number of platform location crossings in spatial probeThe offspring rats in perinatal food restriction(FR50)group crossed the location of platform fewer times than the control group,*P＜0.05,FR50 group vs.control group

圖4 Morris水迷宮中的平均游泳速度圍產期食物限制(FR50)子代大鼠與對照組相比無明顯差異Fig.4Mean swim speed in the Morris water mazeThere was no difference in mean swim speed of offspring rats between perinatal food restriction(FR50)group and the control group

2.3 圍產期食物限制對海馬CA1區(qū)LTP的影響

實驗分別在6只對照組和食物限制組子代大鼠上進行。在高頻刺激前，正常組大鼠fEPSP斜率的基準值為100.8%±1.4%，食物限制組大鼠fEPSP斜率的基準值為100.1± 3.4%，二者均無顯著差異（P＞0.05）。高頻刺激后，正常組大鼠fEPSP斜率為150%±14%，食物限制組大鼠fEPSP斜率為119%±11%，二者有顯著差異（P＜0.01）（圖5）。

圖5 圍產期食物限制(FR50)和對照組子代成年大鼠海馬CA1區(qū)長時程增強的場興奮性突觸后電位斜率的比較箭頭(在30分鐘時)表示應用高頻刺激，以波寬為0.2 ms、頻率為0.033 Hz的刺激作用于Schaffer側枝誘發(fā)場興奮性突觸后電位(fEPSP)。fEPSP的斜率表示為基準值的百分比，每只動物每兩分鐘記錄的fEPSP斜率平均為一個點，誤差線為平均數的標準誤，食物限制的子代大鼠其海馬CA1區(qū)長時程增強的fEPSP斜率降低Fig.5The fEPSP slopes of LTP in the hippocampcal CA1 area of adult control and perinatal food restriction(FR50)offspring ratsArrow at 30 min indicates application of HFS,fEPSPs were evoked by a 0.2 ms stimulus to the Schaffer collaterals at 0.033 Hz,fEPSP slopes were normalized as percent of baseline values and averaged in 2-min bins for individual animals,error bars represent standard errors of the group means,FR50 offspring rats showed a decreased fEPSP slope of LTP in hippocampal CA1 area

2.4 圍產期食物限制對子代大鼠海馬CA1區(qū)nNOS陽性神經元密度的影響

實驗在9只對照組雄性子代大鼠和8只食物限制組雄性子代大鼠上進行。對照組子代大鼠海馬CA1區(qū)nNOS陽性神經元密度為（17.78±3.76）/mm2，食物限制組大鼠海馬CA1區(qū)nNOS陽性神經元密度為（12.73±1.72）/mm2，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（圖6，圖7）。

圖6 用免疫組化方法觀察的成年子代雄性大鼠海馬CA1區(qū)神經元型一氧化氮合酶(nNOS)陽性細胞的分布(×400)左光鏡圖示對照組的nNOS陽性細胞；右光鏡圖示食物限制組的nNOS陽性細胞。食物限制降低了海馬CA1區(qū)nNOS陽性細胞密度Fig.6The distribution of neuronal NOS(nNOS)-positive cells in the CA1 of the hippocampus in adult male offspring rat using immunohistochemical method(×400)(Left)Light field photomicrographshowingthenNOS-positivecellsinthecontrolgroup;(Right)Lightfield photomicrograph showing the nNOS-positive cells in the FR50 group.FR50 decreased the density of nNOS-positive cells in CA1 area of hippocampus

圖7 海馬CA1區(qū)nNOS陽性細胞密度(數目/mm2)食物限制組海馬CA1區(qū)nNOS陽性細胞密度低于正常組。**P＜0.01，食物限制組與正常組比較Fig.7The density of nNOS positive cells(the number/per mm2)in the CA1 areas of hippocampusThere was less density in nNOS-positive cells within CA1 area of hippocampus in FR50 group than those of the control group.**P＜0.01,FR50 group vs.control group

3 討論

Morris水迷宮所檢測的是，大鼠在多次訓練中學會尋找位置固定的隱蔽平臺，形成穩(wěn)定的空間位置認知的能力。這種空間認知是通過加工空間信息（外界參照物）形成的，是一種以空間坐標系為參照的認知（allocentric cognition），所形成的記憶是一種空間參考記憶（reference memory）。從信息的加工和提取方式來看，這種空間參考記憶進入意識系統(tǒng)，其儲存的機制主要涉及邊緣系統(tǒng)（如海馬）和大腦皮層相關腦區(qū)。因此，Morris水迷宮是一種研究與海馬功能直接相關的空間學習和記憶的模型，能較準確地反映動物的空間學習和記憶能力。

本研究中，對兩組子代成年大鼠所進行的Morris水迷宮行為檢測結果顯示，圍產期食物限制可明顯抑制子代大鼠的學習與記憶能力。學習和記憶不是一種有或無的現(xiàn)象，而是一個過程。大鼠在水迷宮訓練中，刺激（被放入水池中）與反應（辨認空間物體尋找平臺）之間形成了聯(lián)系，并產生相關記憶。本實驗結果顯示，兩組大鼠經過多次的水迷宮訓練后，其逃避潛伏期都明顯縮短。與對照組子代成年大鼠相比，食物限制組子代大鼠在訓練的第2、3、4和5天尋找平臺的潛伏期明顯延長，表現(xiàn)了較弱的學習能力。食物限制組子代大鼠跨越平臺的次數及在目標象限的搜索時間也均明顯小于對照組子代大鼠，表明圍產期食物限制同樣降低了子代的記憶能力。

LTP作為突觸可塑性的一種表現(xiàn)，具有時程長和聯(lián)合的性質。不少學者把LTP與學習和記憶聯(lián)系起來,認為它是學習和記憶功能的可能機制之一。在海馬的三突觸聯(lián)系環(huán)路中，CA1區(qū)LTP與通過Morris水迷宮檢測的空間學習和記憶能力高度相關。在本研究中，食物限制組子代大鼠空間學習和記憶能力的下降及海馬CA1區(qū)LTP抑制，表明圍產期食物限制造成子代大鼠空間學習和記憶能力的下降與海馬CA1區(qū)突觸可塑性降低有關。

LTP的誘導和維持需要多種物質，NO作為細胞內信使被認為參與了這一復雜過程。NOS是NO產生的限速酶。不同的NOS催化產生的NO在不同組織細胞中發(fā)揮著不同的生物學作用。由nNOS產生的NO在學習和記憶過程中起著重要作用[16]。NO從突觸后神經元釋放后擴散到突觸前神經元，增加突觸前神經元谷氨酸的釋放，導致突觸后膜上的NMDA受體和AMPA受體激活，從而易化了LTP的誘導和維持。由于NO半衰期很短，直接測定尚存在技術困難，因此多采用檢測NOS的方法間接反映細胞中的NO含量。本研究中，食物限制組子代大鼠海馬CA1區(qū)nNOS密度降低，提示海馬CA1區(qū)神經元合成NO的能力下降，這可能是食物限制組子代大鼠海馬CA1區(qū)LTP抑制的原因之一。

營養(yǎng)是生命與健康的物質基礎。充足的營養(yǎng)是保證機體正常發(fā)育和行使正常功能的前提。圍產期是機體生長發(fā)育的關鍵時期，也是生命過程中對營養(yǎng)狀況最為敏感的時期。若該期營養(yǎng)不良，會導致子代長期的甚至不可逆的損害效應[17,18]。我們的研究結果表明，圍產期食物限制可能通過抑制NO的產生降低了海馬突觸可塑性，從而對大鼠學習和記憶能力產生影響。由于動物的學習和記憶能力的形成與人類具有一定的相似性，因此本研究可為認識圍產期食物限制對人類智力的影響提供參考。

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Abstract:Perinatal food restriction induces neurobiological changes,including deficiency in learning and memory,in rat offspring.However,the mechanism is still unclear.The females were paired with the males. Afterwards,the pregnant rats were assigned radomly into two groups:the control group and the model group.In the control group(n=9),dams had free access to diet and water during gestation and lactation.In the model group,dams(n=8)received 50%of the daily food intake of control mothers from gestation day 7 until the postnatal day 21.Spatial learning and memory ability was tested in Morris water maze in adult offspring rats.Afterwards,thein vivofield excitatory postsynaptic potential(fEPSP)was observed in the hippocampal CA1 area.In addition,the density of nNOS neurons in hippocampal CA1 area was recorded using immunohistochemistry.The results showed that the perinatal food restriction reduced body weight of offsprings on postnatal day(PD)1,PD7,PD10,PD14 and PD21,and impaired learning and memory of adult male offspring rats.This type of food restriction also decreased fEPSP slope of long-term potentiation(LTP) in hippocampal CA1 area.Importantly,the density of nNOS positive cells in hippocampal CA1 area was decreased by this type of food restriction.These findings suggested that perinatal food restriction impaired synaptic plasticity by reducing the product of NO in hippocampal CA1 area,and induced learning and memory disturbances in offspring rats.

Key Words:Hippocampus;Learning and memory;Long-term potentiation;Nitric oxide;Food restriction; Perinatal period

Effects of Perinatal Food Restriction on Synapticity in Hippocampal CA1 Area in Adult Offspring Rats

ZHANG Yinguo1,LI Ning2,YANG Jiajia1,ZHANG Tao1,YANG Zhuo2

1.College of Life Science,The Key Laboratory of Bioactive Materials,Ministry of Education, Nankai University,Tianjin 300071,China;
2.School of Medicine,Nankai University,Tianjin 300071,China

Q426

2009-12-07；接受日期：2010-01-14

國家自然科學基金項目(30870827)

楊卓，電話：(022)23504364，E-mail：zhuoyang@nankai.edu.cn

This work was supported by a grant from The National Natural Science Foundation of China(30870827)

Received:Dec 7,2009Accepted:Jan 14,2010

Corresponding author:YANG Zhuo,Tel:+86(22)23504364,Fax:+86(22)23502554,E-mail:zhuoyang@nankai.edu.cn