脫脂乳發(fā)酵過(guò)程中β-乳球蛋白和α-乳白蛋白抗原性變化規(guī)律＊

張穎,布冠好,2,鄭喆,羅永康

1(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京,100083) 2(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院,河南鄭州,450052)

脫脂乳發(fā)酵過(guò)程中β-乳球蛋白和α-乳白蛋白抗原性變化規(guī)律＊

張穎1,布冠好1,2,鄭喆1,羅永康1

1(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京,100083) 2(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院,河南鄭州,450052)

選擇 8株乳酸菌對(duì)脫脂乳進(jìn)行發(fā)酵,通過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng) EL ISA法測(cè)定了不同菌種、發(fā)酵時(shí)間、冷藏時(shí)間下發(fā)酵乳中β-乳球蛋白(β-LG)和α-乳白蛋白(α-LA)的殘留抗原性。結(jié)果表明,經(jīng)不同乳酸菌發(fā)酵 12 h后,發(fā)酵乳中β-LG和α-LA的抗原性均出現(xiàn)不同程度的下降,且菌株間差異顯著。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),β-LG和α-LA的抗原性在 3～12 h內(nèi)迅速下降,下降速度為瑞士乳桿菌 >保加利亞乳桿菌 >嗜熱鏈球菌,復(fù)合菌株發(fā)酵對(duì)降低抗原性具有協(xié)同效果;繼續(xù)發(fā)酵至 48h,抗原性變化緩慢。瑞士乳桿菌發(fā)酵乳在 4℃冷藏 7 d后,與冷藏前相比,α-LA的抗原性下降 5%左右,而β-LG的抗原性無(wú)顯著變化。

抗原性,發(fā)酵,乳酸菌,β-乳球蛋白,α-乳白蛋白

牛乳是較易引起過(guò)敏的食物之一,大約有 2%～6%的嬰幼兒對(duì)乳蛋白質(zhì)有不同程度的過(guò)敏。乳蛋白中主要過(guò)敏原為乳清蛋白中的β-乳球蛋白(β-LG)和α-乳白蛋白(α-LA)。牛乳蛋白過(guò)敏可引起過(guò)敏性鼻炎、哮喘、濕疹、腹瀉、胃腸出血等疾病,甚至?xí)?dǎo)致過(guò)敏性休克,嚴(yán)重影響嬰幼兒的健康成長(zhǎng)[1]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),發(fā)酵乳制品具有改善消化、降低血中膽固醇、抗菌、抗癌等多種功能,日常膳食中食用發(fā)酵乳還能預(yù)防、減輕過(guò)敏癥狀[2-3]。Majamaa[4]研究表明,牛奶過(guò)敏嬰兒食用乳酸菌水解的乳清蛋白 1個(gè)月后,嬰兒的腸道炎癥可得到有效緩解。

關(guān)于采用乳酸菌發(fā)酵來(lái)降低乳清蛋白過(guò)敏原的研究國(guó)外已有一些報(bào)道。W róblewska[5]證明,牛乳經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后,β-LG和α-LA的抗原性降低 99%以上;Kleber[6]用乳酸菌發(fā)酵脫脂乳、甜乳清后,β-LG抗原性分別降低了 90%和 70%;Maier[7]研究指出,酸乳中β-LG的消化率比生牛乳提高 30%,不同發(fā)酵方式酸乳中蛋白的抗原性降低程度存在差異。而B(niǎo)ritt[8]用瑞士乳桿菌對(duì)脫脂乳發(fā)酵 113 h后,β-LG含量雖逐漸減低,但 IgE介導(dǎo)的β-LG抗原性卻沒(méi)有顯著變化?？梢钥闯?目前關(guān)于通過(guò)乳酸菌發(fā)酵來(lái)降低乳清蛋白抗原性的研究結(jié)果差異較大,同時(shí)對(duì)發(fā)酵過(guò)程中乳清蛋白抗原性的變化規(guī)律也缺乏系統(tǒng)的研究。

本實(shí)驗(yàn)選擇 8株乳酸菌對(duì)脫脂乳進(jìn)行發(fā)酵,研究了不同菌種、發(fā)酵時(shí)間、冷藏時(shí)間對(duì)發(fā)酵乳中β-LG和α-LA抗原性的影響,并通過(guò)測(cè)定發(fā)酵乳的 pH值和游離氨基酸含量,初步探討了導(dǎo)致發(fā)酵過(guò)程中乳清蛋白抗原性變化的原因,從而為低致敏牛乳制品的開(kāi)發(fā)提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 乳酸菌菌種

乳酸菌菌種共 8株:德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)S-5、S-7、S-7＊,干酪乳桿菌(Lactobacillus casei),來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院功能乳品實(shí)驗(yàn)室。瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus),干酪乳桿菌 Zhang(Lactobacillus casei),嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus),嗜熱鏈球菌(Streptococcus ther m ophilus),來(lái)自吉林農(nóng)科院和內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)。

1.2 試劑

β-乳球蛋白(編號(hào) L3908)、α-乳白蛋白(編號(hào)L5385)、羊抗兔 IgG-HRP(1:10000,編號(hào) A6154)、三硝基苯磺酸(編號(hào) P2297),均為 Sigma公司;抗體為兔抗β-LG血清,兔抗α-LA血清,自制;L-亮氨酸,上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司;脫脂奶粉,新西蘭進(jìn)口,其中水分3.8%,蛋白質(zhì) 33.4%,脂肪 0.8%,灰分 7.9%。

1.3 儀器與設(shè)備

96孔酶標(biāo)板(聚苯乙烯),Costar;Thermo Multiskan MK3酶標(biāo)儀,Ther mo Electron公司;YT-CJ-1ND超凈工作臺(tái),北京亞泰科隆實(shí)驗(yàn)技術(shù)開(kāi)發(fā)中心;YXQLS-18SI高壓蒸汽滅菌鍋,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;Merttle Toledo酸度計(jì);UV-2600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),尤尼柯(上海)儀器有限公司;W201電熱恒溫水浴鍋,上海申生科技有限公司;LRH-250生化培養(yǎng)箱,上海一恒科技有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 乳酸菌的活化及傳代[9]

在無(wú)菌超凈工作臺(tái)中,挑取少量菌種凍干粉,轉(zhuǎn)移到 10%脫脂乳培養(yǎng)基(115℃,15 min滅菌)中,傳代培養(yǎng) 2～3次,使各菌株活力充分恢復(fù)。菌株活化好后,劃線培養(yǎng)于 MRS或 M17固態(tài)培養(yǎng)基的平板上,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至長(zhǎng)出合適大小的菌落。挑單菌落鏡檢觀察所得菌株是否為純菌。若菌株已經(jīng)為純菌,則進(jìn)行下步實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 發(fā)酵乳樣品的制備

將脫脂乳粉按照 12.5%的質(zhì)量比復(fù)原為脫脂乳,經(jīng) 90℃,5 min熱處理后,冷卻至 45℃,在無(wú)菌超凈工作臺(tái)中進(jìn)行乳酸菌接種。按 2%(v/v)的接種量接入單株或復(fù)合菌株發(fā)酵劑,搖勻后于 37℃(桿菌)或 42℃(球菌和復(fù)合菌)生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)酵。分別于 0,3,6,9,12,18,24,36,48 h取樣,攪拌均勻后在 4℃下、8000 r/min離心 10 min,取上清液分裝于小管,-20℃凍藏待測(cè)。發(fā)酵乳凝乳后放 4℃冷藏,分別于 0,0.25,0.5,1,2,3,4,5,6,7 d取樣,以下步驟同上。

1.4.3 發(fā)酵乳 pH值的測(cè)定

用Merttle Toledo酸度計(jì)測(cè)定 pH值。

1.4.4 發(fā)酵乳中游離氨基酸含量的測(cè)定

采用三硝基苯磺酸(trinitrobenzene sulfonic acid,TNBS)法測(cè)定發(fā)酵乳中游離氨基酸含量[10],以衡量發(fā)酵乳中蛋白水解程度。

1.4.5 發(fā)酵產(chǎn)物抗原性測(cè)定

采用間接競(jìng)爭(zhēng) EL ISA方法測(cè)定發(fā)酵乳中β-LG和α-LA的殘余抗原性[11]。

間接競(jìng)爭(zhēng) EL ISA中被測(cè)物和包被抗原競(jìng)爭(zhēng)與抗體結(jié)合,因此包被抗原與抗體生成復(fù)合物的量與被測(cè)物中抗原量成反比。被測(cè)物的抗原性大小可用抗原殘留量表示,按下式計(jì)算:

其中,B表示各被測(cè)樣品的 OD值,B0為無(wú)競(jìng)爭(zhēng)體系的OD值。

1.4.6 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用 SAS9.0軟件(SAS Institute Inc.,Cary,NC,USA)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA),用鄧肯氏多變域檢測(cè)法確定數(shù)據(jù)間的差異,P<0.05表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳酸菌菌種對(duì)發(fā)酵乳中乳清蛋白抗原性的影響

8株乳酸菌發(fā)酵脫脂乳 12 h后,發(fā)酵乳中β-LG和α-LA抗原性、pH值、游離氨基酸濃度見(jiàn)表 1。脫脂乳經(jīng) 90℃,5 min處理后,β-LG和α-LA的抗原性有所升高,這主要是因?yàn)闊崽幚硎沟鞍踪|(zhì)變性,較多隱藏的抗原表位暴露出來(lái)[12]。發(fā)酵 12 h后,脫脂乳中β-LG和α-LA的抗原性均出現(xiàn)不同程度的降低,不同菌株間差異顯著,以瑞士乳桿菌效果為最佳,β-LG和α-LA抗原性分別降低了 47.23%和 33%,而嗜熱鏈球菌效果最差,β-LG和α-LA抗原性?xún)H分別降低了 16.93%和 16.77%。W róblewska[5]對(duì)滅菌乳(110℃,10 min)采用嗜溫和嗜熱乳酸菌或復(fù)合菌進(jìn)行發(fā)酵,凝乳后乳清蛋白的抗原性比生乳降低 99%以上。Kleber[6]的研究表明,90℃,40 min熱處理的脫脂乳經(jīng)不同乳酸菌發(fā)酵 24 h后,β-LG抗原性降低了 84%～98%。這或許說(shuō)明發(fā)酵前熱處理的溫度對(duì)抗原性的變化有一定的影響,或者是菌株來(lái)源的不同導(dǎo)致上述差異[13-14]。表 1也表明,脫脂乳經(jīng) 3株不同來(lái)源的保加利亞乳桿菌發(fā)酵后,β-LG和α-LA的抗原殘留量、pH值及游離氨基酸濃度有一定差別。

表1 脫脂乳經(jīng)不同乳酸菌發(fā)酵 12 h后β-LG和α-LA抗原性、pH值、游離氨基酸濃度

另外,從表 1可知,瑞士乳桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌發(fā)酵乳的 pH較低,游離氨基酸濃度較高,對(duì)應(yīng)發(fā)酵乳中β-LG和α-LA的抗原性低;而嗜熱鏈球菌發(fā)酵乳的 pH較高,游離氨基酸濃度較低,其β-LG和α-LA的抗原性比較高。這或許說(shuō)明發(fā)酵乳的酸度、游離氨基酸含量及蛋白抗原性 3者之間存在一定的關(guān)聯(lián)性。

2.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵乳中乳清蛋白抗原性的影響

選取保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、瑞士乳桿菌及桿菌與球菌以 1∶1比例復(fù)合菌株對(duì)脫脂乳進(jìn)行發(fā)酵,于不同發(fā)酵時(shí)間取樣,測(cè)定發(fā)酵樣品中 pH值、游離氨基酸濃度及β-LG和α-LA的抗原性。

乳酸菌在乳中生長(zhǎng)時(shí)將乳糖轉(zhuǎn)化為乳酸使酸度上升,pH值下降。從圖 1可知,發(fā)酵前 12 h,發(fā)酵乳的 pH值下降很快,如瑞士乳桿菌和嗜熱鏈球菌復(fù)合菌發(fā)酵 12 h后,pH由 6.55下降至 3.78;繼續(xù)發(fā)酵pH值下降變化緩慢。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)不同乳酸菌發(fā)酵乳中 pH的影響

發(fā)酵乳中游離氨基酸的濃度反映了在一定條件下菌體蛋白酶活力的強(qiáng)弱,即菌體水解乳蛋白能力的大小。從圖 2可知,發(fā)酵 0～12 h,發(fā)酵乳中游離氨基酸濃度大幅提高,特別是瑞士乳桿菌的蛋白酶水解活力較高,發(fā)酵 12h時(shí)游離氨基酸濃度達(dá)到 8.84 mmol/L,可能此階段乳酸菌數(shù)量增長(zhǎng)快,活力高,產(chǎn)生了較多的蛋白酶來(lái)水解乳蛋白[13];繼續(xù)發(fā)酵,除保加利亞乳桿菌發(fā)酵乳中游離氨基酸含量仍逐漸增加外,其它菌株及復(fù)合菌變化不大。目前關(guān)于乳酸菌降低乳致敏性機(jī)理,被廣為接受的理論有 2個(gè):一是乳酸菌可產(chǎn)生 I型及 II型干酪素,通過(guò)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制防止過(guò)敏;另一種,可能是乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生了水解乳蛋白的蛋白酶,進(jìn)而水解乳蛋白造成[15]。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)不同乳酸菌發(fā)酵乳中游離氨基酸濃度的影響

圖3和圖 4分別是不同乳酸菌發(fā)酵乳中β-LG和α-LA抗原性隨發(fā)酵時(shí)間的變化規(guī)律。可以看出,β-LG、α-LA抗原性變化和菌體發(fā)酵過(guò)程是密切相關(guān)的。發(fā)酵 3～12 h,脫脂乳中β-LG和α-LA的抗原性迅速下降,下降速度快慢依次為瑞士乳桿菌 >保加利亞乳桿菌 >嗜熱鏈球菌,保加利亞乳桿菌發(fā)酵脫脂乳12 h后,其β-LG抗原殘留量由 99.85%下降至71.68%,α-LA抗原殘留量由 96.35%下降至72.78%。此階段發(fā)酵乳中的游離氨基酸含量也在大幅提高,說(shuō)明β-LG和α-LA抗原性的顯著下降與乳酸菌產(chǎn)生的蛋白酶水解其抗原表位有關(guān)。據(jù)報(bào)道,不同乳酸菌菌種產(chǎn)生的蛋白酶具有特異性,桿菌對(duì)乳蛋白的肽鏈內(nèi)切酶活性要遠(yuǎn)高于球菌,而嗜熱鏈球菌僅有有限的蛋白水解酶活性[16-18]。從圖 3和圖 4也可以看出,復(fù)合菌株發(fā)酵乳中乳清蛋白的抗原性下降速度更快,脫脂乳發(fā)酵6h后,瑞士乳桿菌中β-LG和α-LA抗原殘留量為 90.77%和 80.90%,嗜熱鏈球菌中β-LG和 α-LA抗原殘留量則為 99.68%和95.78%,而瑞士乳桿菌和嗜熱鏈球菌復(fù)合菌中β-LG和α-LA抗原殘留量?jī)H為 59.64%和 66.95%,說(shuō)明復(fù)合菌株發(fā)酵對(duì)降低乳清蛋白抗原性具有協(xié)同效果,這與 Kleber的研究結(jié)果相一致[6]。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)不同乳酸菌發(fā)酵乳中β-乳球蛋白抗原性的影響

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)不同乳酸菌發(fā)酵乳中α-乳白蛋白抗原性的影響

繼續(xù)發(fā)酵至 48 h,發(fā)酵乳中乳清蛋白抗原性變化減緩,其中保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌發(fā)酵乳的抗原性繼續(xù)緩慢下降,可能是菌體產(chǎn)生的蛋白酶繼續(xù)酶解所致;而瑞士乳桿菌及其復(fù)合菌發(fā)酵乳抗原性則緩慢升高,則可能是因?yàn)槿榍宓鞍捉?jīng)蛋白酶水解為大肽后,菌株產(chǎn)生的肽酶又將大肽進(jìn)一步水解,產(chǎn)生了更小的肽段和氨基酸,導(dǎo)致一些隱性表位或線性表位的暴露。這種差異與不同乳酸菌產(chǎn)生的蛋白酶具有特異性有一定關(guān)系[19-20]。

另外,圖 3和圖 4表明,各乳酸菌發(fā)酵對(duì)于β-LG和α-LA抗原性影響呈正相關(guān),并且β-LG的抗原性較α-LA降低效果更好?？赡苁怯捎诎l(fā)酵前劇烈的熱處理使β-LG變性程度較大,空間結(jié)構(gòu)充分展開(kāi),更易于蛋白酶的水解[7,17]。

2.3 冷藏時(shí)間對(duì)發(fā)酵乳中乳清蛋白抗原性的影響

脫脂乳經(jīng)瑞士乳桿菌發(fā)酵凝乳后,放入 4℃冷藏,于不同冷藏時(shí)間取樣進(jìn)行測(cè)定。圖 5顯示的是冷藏不同時(shí)間后瑞士乳桿菌發(fā)酵乳中β-LG和α-LA抗原性的變化情況。隨冷藏時(shí)間延長(zhǎng),發(fā)酵乳的α-LA的抗原性緩慢下降,與冷藏前相比,冷藏 7 d后α-LA抗原性下降 5%左右,但β-LG抗原性的變化不顯著。從圖 6可以看到,在冷藏期間,瑞士乳桿菌發(fā)酵乳的pH仍在緩慢下降,游離氨基酸濃度仍在緩慢升高,說(shuō)明雖然冷藏期間乳酸菌生長(zhǎng)和代謝變得緩慢,但乳酸菌產(chǎn)生的蛋白酶仍在水解蛋白質(zhì),只是可能由于溫度低、pH不適宜等因素造成蛋白水解酶活力下降,從而導(dǎo)致發(fā)酵乳中β-LG和α-LA抗原性變化幅度不大。

3 結(jié)論

脫脂乳經(jīng)保加利亞乳桿菌、瑞士乳桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌發(fā)酵 12 h后,其β-LG和α-LA的抗原性均出現(xiàn)不同程度的降低,不同菌株間差異顯著,以瑞士乳桿菌效果為最佳。

圖5 瑞士乳桿菌發(fā)酵乳 4℃冷藏下β-LG和α-LA抗原性隨冷藏時(shí)間的變化

圖6 瑞士乳桿菌發(fā)酵乳 4℃冷藏下游離氨基酸濃度和 pH隨冷藏時(shí)間的變化

隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng),發(fā)酵乳中β-LG和α-LA的抗原性均先迅速下降后變化緩慢,抗原性下降速度依次為:瑞士乳桿菌 >保加利亞乳桿菌 >嗜熱鏈球菌,復(fù)合菌株發(fā)酵對(duì)降低β-LG和α-LA的抗原性具有協(xié)同作用;但繼續(xù)發(fā)酵至 48 h,發(fā)酵乳中蛋白抗原性變化緩慢,變化趨勢(shì)具有菌種特異性。瑞士乳桿菌發(fā)酵乳在 4℃冷藏 7d后,與冷藏前相比,α-LA的抗原性下降 5%左右,但β-LG的抗原性無(wú)顯著變化。

發(fā)酵乳中β-LG、α-LA抗原性變化和菌體發(fā)酵過(guò)程密切相關(guān),乳酸菌產(chǎn)生的蛋白水解酶對(duì)降低乳清蛋白抗原性起著重要的作用。但發(fā)酵乳作為一個(gè)非常復(fù)雜的體系,其β-LG和α-LA抗原性的變化可能受多種因素的影響,發(fā)酵前熱處理溫度、發(fā)酵過(guò)程中生成的乳酸和牛乳體系中酪蛋白等對(duì)β-LG和α-LA抗原性的影響都有待進(jìn)一步研究。

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ABSTRACTIn this study,skim milk was fermented with eight lactic acid bacteria and the residual antigenicity of β-lactoglobulin(β-LG)andα-lactalbumin(α-LA)was determined bymeansof indirect competitive EL ISA at different fer mentation and storage time.The results showed that lactic acid bacteria fer mentation can reduce antigenicity of β-LG andα-LA significantly.Fermenting for 3-12h,antigenicity ofβ-LG andα-LA decreased rapidly and the descending speed was Lactobacillus helveticus>Lactobacillus bulgaricus>Streptococcus ther mophilus;Multi-bacteria fer mentation had collaborative effect.However,antigenicity changed slowly with further fer menting.Compared with pre-refrigeration,theα-LA antigenicity in Lactobacillus helveticus fer mented milk decreased by 5%after storage at 4℃ for 7d,while no significant variationswere found inβ-LG.

Key wordsantigenicity,fer mentation,lactic acid bacteria,β-lactoglobulin,α-lactalbumin

Research on the Antigen icity ofβ-LG andα-LA in the Process of Sk im Milk Fermentation

Zhang Ying1,Bu Guan-hao1,2,Zheng Zhe1,Luo Yong-kang1
1(College of Food Science and Nutritional Engineering,China AgriculturalUniversity,Beijing 100083,China)
2(College of Cereal and Food Science,Henan University of Technology,Zhengzhou 450052,China)

碩士研究生(羅永康教授為通訊作者)。

＊國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30871817,30471224)

2010-04-01