枇杷多酚氧化酶酶學(xué)特性的研究

史輝，鄭玉平，阮少江，陳勇

（寧德師范學(xué)院生物系，福建寧德352100）

枇杷多酚氧化酶酶學(xué)特性的研究

史輝，鄭玉平，阮少江，陳勇

（寧德師范學(xué)院生物系，福建寧德352100）

采用分光光度法，研究枇杷多酚氧化酶（PPO）的特性，包括不同溫度、pH值、底物濃度和抑制劑對PPO活性的影響，以及PPO的熱穩(wěn)定性。結(jié)果表明：枇杷PPO的最適酶促反應(yīng)溫度為20℃；最適pH值為6.4；Km為0.020 mol/L，Vm為10.49ΔA/min·g·FW；80℃熱處理50 s可鈍化PPO的活性；抗壞血酸和亞硫酸鈉為強烈抑制劑，質(zhì)量分數(shù)為4227 mg/kg·FW的抗壞血酸和4537 mg/kg·FW的亞硫酸鈉能有效抑制PPO的活性。

枇杷；多酚氧化酶；特性；褐變

Abstract:The Characteristics of polyphenoloxidase of loquat were studied in this thesis by spectrophotometry,including the effects of different temperature,pH,concentration of substrate and inhibitors on PPO activity,as well as stability to heat.The results showed that the optimum temperature of PPO was 20℃and the optimum pH was 6.4.Km value and Vm value of PPO were 0.020 mol/L and 10.49 ΔA/min·g·FW respectively.The extinct condition of PPO was 50 seconds at 80℃.Ascorbic acid and sodium sulfite were strong inhibitors,with the effective concentration being 4227 mg/kg·FW and 4537 mg/kg·FW respectively.

Key words：Loquat;polyphenoloxidase;property;browning

枇杷（Eriobotrya japonica Lindl）別名盧橘，屬薔薇科，是我國南方特有的珍稀水果。枇杷不但味道鮮美，營養(yǎng)豐富，而且有很高的保健價值。《本草綱目》記載“枇杷能潤五臟，滋心肺”，中醫(yī)傳統(tǒng)認為，枇杷果有祛痰止咳、生津潤肺、清熱健胃之功效。而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)更證明，枇杷果中含有豐富的維生素、苦杏仁甙和白蘆梨醇等防癌、抗癌物質(zhì)。枇杷可釀酒；也可制成枇杷罐頭、果脯、果汁。

九都鎮(zhèn)是寧德市蕉城枇杷生產(chǎn)基地，現(xiàn)全鎮(zhèn)已發(fā)展枇杷種植面積約460 hm2，并在進一步擴大，并逐漸形成該區(qū)主導(dǎo)特色農(nóng)產(chǎn)品。但枇杷果實在加工和貯藏中極易褐變，影響產(chǎn)品色澤、風(fēng)味，同時還破壞營養(yǎng)成分，嚴重影響水果的品質(zhì)，這是導(dǎo)致其不耐貯藏和運輸?shù)闹饕?，給生產(chǎn)帶來巨大損失。

很多研究表明，果實在加工和貯藏過程中的褐變主要是酶促褐變，即組織體內(nèi)的酚類物質(zhì)在多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）的作用下氧化成醌類，醌類再聚合形成褐色物質(zhì)，從而導(dǎo)致組織變色[1]。正常的組織不發(fā)生褐變與細胞內(nèi)酚類物質(zhì)和酶的區(qū)域化分布有關(guān)[2]，在植物體內(nèi)PPO主要存在于完整細胞的質(zhì)體（包括葉綠體、有色體和白色體）和微體中，而PPO的底物存在于液泡中，當(dāng)組織損傷引起亞細胞區(qū)域化改變時，則為底物和酶的接觸創(chuàng)造了條件，引起褐變[3-4]。

不同果蔬中PPO的特性各不相同，人們已經(jīng)對許多果蔬中的PPO特性進行了研究，如蘋果[5]、梨[6]、香蕉[7]、山藥[8]、蓮藕[9]、馬鈴薯[10]、桃[11]、葡萄[12]、甜柿[13]。但對導(dǎo)致枇杷果實褐變的關(guān)鍵酶類——多酚氧化酶（PPO）的特性及影響該酶活性的因素的報道較少。為了深入探討該酶促褐變的特性，本試驗以枇杷果實為材料，研究了pH、溫度、底物濃度、抑制劑等因素對多酚氧化酶活性的影響，以期為控制枇杷果實在加工和貯藏過程中的酶促褐變提供技術(shù)參數(shù)，對發(fā)展枇杷種植業(yè)，增加農(nóng)民收入具有非常重要的經(jīng)濟意義和社會效益。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試枇杷品種為“解放鐘”，采于寧德九都。選擇成熟度一致、大小均勻、無病蟲害、無機械傷、無褐變的果實。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 試劑

鄰苯二酚、檸檬酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、亞硫酸鈉、抗壞血酸等主要試劑均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2.2 主要儀器

高速冷凍離心機（3-18K）：Sigma；制冰機（AF100-AS）：Scotsman；低溫冷卻液循環(huán)泵（DL-1005）：南京先歐；電熱恒溫水浴鍋（HH-6）、組織搗碎機（JJ-2）：上海比朗；可見分光光度計（VIS-7220N）：北京瑞利；微量移液器：芬蘭雷勃。

1.3 方法

1.3.1 PPO酶液的制備

枇杷果實洗凈去皮去核后，按1:1（g/mL）比例加入預(yù)冷的0.05 mol/L pH6.4磷酸鹽緩沖液，低溫搗碎至勻漿，10000 r/min離心20 min，上清液即為酶的粗提液，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PPO活力的測定

參考黃建韶的方法略有改動[14]。在1 cm比色皿中，加入1.9 mL的0.1 mol/L磷酸緩沖溶液和1 mL的0.1 mol/L鄰苯二酚溶液，最后加入PPO酶液0.1 mL，在420 nm處比色測定PPO的活性，以蒸餾水作為空白對照。酶液加入后開始計時，混勻，30 s后第一次讀數(shù)，然后每10 s記錄一次OD420nm隨時間的變化值。PPO活力定義為：每克鮮果肉每分鐘引起吸光值的變化量，即 Un420=ΔA/min·g·FW（20 ℃，pH 6.4）。測量 3次，取平均值。

1.3.3 pH對PPO活性的影響

調(diào)整反應(yīng)體系的pH水平，以0.4為一個pH梯度，在pH為4.0~8.0（檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液：pH4.0~5.6，磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液：pH6.0~8.0）的范圍內(nèi)測定PPO的活性。

1.3.4 溫度對PPO活性的影響

以5℃為一個溫度梯度，把0.1 mol/L磷酸緩沖溶液（pH6.4）、0.1 mol/L鄰苯二酚溶液（pH為6.4的磷酸緩沖溶液）和酶液，置于10℃~50℃范圍內(nèi)的不同溫度的水浴中保溫10min后，加入1cm比色皿中，在420nm處比色測定PPO的活性。

1.3.5 底物濃度與PPO活性的關(guān)系

以0.01 mol/L為一個濃度梯度，測定0.01 mol/L~0.1 mol/L不同濃度鄰苯二酚溶液對PPO活性的影響。

1.3.6 抑制劑對PPO活性的影響

以0.1 mmol/L為一個濃度梯度，測定0.1 mmol/L~0.6 mmol/L不同濃度的亞硫酸鈉和抗壞血酸對PPO活性的影響。

1.3.7 PPO熱穩(wěn)定性的測定

將PPO酶液分別在60、70、80℃水浴中處理一定時間后，立即放冰浴冷卻5 min后，在20℃下測定PPO的殘留活性（pH6.4）。

2 結(jié)果與討論

2.1 溫度和pH對PPO活性的影響

溫度和pH對PPO活性的影響見圖1。

如圖1（a）所示，枇杷PPO在20℃時活性最高，為枇杷PPO的最適溫度，高于或低于20℃時酶活性急劇下降。溫度對PPO反應(yīng)速度的影響包括兩個方面：一，因溫度升高對酶的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不利影響，從而使酶活力下降；二，溫度升高又加快反應(yīng)速度，一般來說，每當(dāng)溫度增加10℃，酶促反應(yīng)速度增加1倍，因此，PPO的最適溫度是這兩種影響綜合作用的結(jié)果[15]。20℃以下時，溫度對枇杷PPO酶促反應(yīng)的加速起主導(dǎo)作用，但溫度繼續(xù)升高時，高溫對酶蛋白的破壞起主導(dǎo)作用，PPO的活性呈下降趨勢，至溫度更高時PPO失活。在生產(chǎn)工藝中，對枇杷鮮果可采用低溫冷藏的方法來抑制酶促褐變，而對加工產(chǎn)品則可通過適當(dāng)?shù)臒崽幚韥磉_到一定的防褐效果。

從圖1（b）中PPO相對活性與pH值的關(guān)系曲線可知，枇杷PPO最適pH值為6.4，偏酸性。pH值對枇杷的PPO活性影響很大，體現(xiàn)了PPO活力強烈依賴于pH值的大小。因為PPO為含銅蛋白酶，當(dāng)pH值較低時，一方面，酶中的銅被解離出來，使酶失活；另一方面，酸性條件下，蛋白質(zhì)變性也使酶失活，當(dāng)pH值較高時，銅與酶蛋白脫離，生成不溶性Cu(OH)2，也會使酶失活[6]。因此，在枇杷果實加工過程中調(diào)節(jié)pH值可減少褐變的發(fā)生。

2.2 底物濃度對PPO活性的影響及酶促反應(yīng)動力學(xué)研究

底物濃度對PPO活性的影響結(jié)果見圖2。

從圖2（a）可以看出，鄰苯二酚的濃度對反應(yīng)初速率的影響很大，在濃度較小時呈直線上升，當(dāng)?shù)孜餄舛壤^續(xù)增加時反應(yīng)速度增加緩慢，不再呈直線關(guān)系，最后趨于極限值。這是由于在底物濃度較低時，并非所有的酶分子都能與底物相結(jié)合。隨著底物濃度增加，越來越多的酶分子都與底物結(jié)合，此時酶被底物飽和，進一步提高底物濃度也不能提高酶的活性[16]。

以鄰苯二酚為底物，如圖2（b）所示，根據(jù)Lineweaver-Burk作圖法，以1/V為縱座標(biāo)，1/S為橫座標(biāo)作圖，得到回歸方程：y=0.0019x+0.0953相關(guān)系數(shù)R=0.9987。根據(jù)米氏方程：1/V=（Km/Vm）×（1/S）+1/Vm，1/Vm=0.0953，Km/Vm=0.0019。求得Km即米氏常數(shù)為0.020mol/L，Vm既酶催化反應(yīng)速度最高值為10.49△A/min·g·FW。Km值代表反應(yīng)速度達到最大速度一半時的底物濃度，反應(yīng)酶與底物的親合力，Km越小，酶與底物的親合力越大[16]。在測定酶活性時可通過Km大小選擇酶的最適底物（Km值最小的底物）及其用量（大于Km值的5倍），從而使測定的結(jié)果更為可靠[17]。

2.3 抑制劑對PPO活性的影響

抑制劑對PPO活性的影響見圖3。

抗壞血酸、亞硫酸鈉對PPO活性的抑制作用如圖3（a）可知，隨著各抑制劑濃度的增加，PPO活性也隨著下降。多酚氧化酶是一種含銅的酶。該酶的抑制劑可以有兩種類型：一種是與酶中銅起作用抑制酶活性；另一種是通過影響底物(如酚類化合物)與酶活性中心結(jié)合部位的作用而抑制酶的活性?？箟难釋PO活性的抑制機理主要是將Cu2+還原成Cu+，同時抗壞血酸具有還原性，能把酶促反應(yīng)的中間產(chǎn)物——鄰苯醌還原成鄰苯二酚而抑制褐變[18]；亞硫酸鈉主要是通過不可逆地與醌形成穩(wěn)定的無色加成物而抑制褐變[19]，與此同時，降低了酶作用于一元酚和二羥基酚的活力。由圖3（a）可知，抗壞血酸和亞硫酸鈉對PPO均有明顯抑制效果，濃度為0.4 mmol/L的抗壞血酸和0.6 mmol/L的亞硫酸鈉能有效抑制PPO的活性，換算成質(zhì)量分數(shù)即為4227 mg/kg·FW的抗壞血酸和4537 mg/kg·FW的亞硫酸鈉能有效抑制PPO的活性。抗壞血酸為枇杷的固有營養(yǎng)成分，安全性高，抑制效果可以完全取代化學(xué)藥劑（亞硫酸鈉），是理想的抑制劑；而亞硫酸鈉則要考慮亞硫酸鹽在果實制品中的殘留。由圖3（b）可知，濃度為0.06 mol/L即質(zhì)量分數(shù)為756.5 g/kg·FW的檸檬酸能有效抑制PPO的活性，可知檸檬酸不是PPO的抑制劑，檸檬酸對PPO的活性的影響主要是通過調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值來實現(xiàn)的；且檸檬酸的用量太大，通過其調(diào)節(jié)PPO的活性不經(jīng)濟。

2.4 PPO的熱穩(wěn)定性

PPO的熱穩(wěn)定性結(jié)果見圖4。

多酚氧化酶是蛋白酶，其活性部位空間結(jié)構(gòu)的完整性對保持酶的活力是必要的，任何影響酶空間結(jié)構(gòu)完整性的因素將影響它的活力。由圖4 a圖可以看出，枇杷PPO比較耐高溫，60℃高溫處理時，隨著處理時間的延長，酶促反應(yīng)速度呈下降趨勢，但處理時間超過4 min時其活性下降變緩慢并趨與平衡，處理10 min后還殘留30%的活性，意味著該溫度下短時間處理，不能有效滅活酶的活性。70℃高溫處理時，1 min后其活性只有44.6%，2 min后其活性只有10.9%，到4 min時其活性幾乎喪失。由圖4 b圖可知，在80℃下處理50 s就可以使PPO活性完全失活。因此可以使用高溫處理的方法鈍化PPO，但高溫處理時間太長會破壞營養(yǎng)成分及風(fēng)味，故在枇杷加工過程中可采用不低于80℃的高溫瞬時熱燙來鈍化PPO的活性，也可以結(jié)合其它手段來達到抑制褐變的目的。

3 結(jié)論

本試驗針對從枇杷果實中提取的多酚氧化酶，對其特性進行研究，以鄰苯二酚為底物，測定了不同pH值、溫度、底物濃度和抑制劑對多酚氧化酶活性的影響。結(jié)果表明，pH值、溫度、抑制劑和底物濃度顯著影響多酚氧化酶的活性，體現(xiàn)了酶對反應(yīng)介質(zhì)的強烈依賴性。以鄰苯二酚為底物，枇杷PPO的最適酶促反應(yīng)溫度為20℃；最適pH值為6.4；Km為0.020 mol/L，Vm為 10.49ΔA/min·g·FW；80℃熱處理 50 s可鈍化 PPO的活性；抗壞血酸和亞硫酸鈉為強烈抑制劑，質(zhì)量分數(shù)為4227 mg/kg·FW的抗壞血酸和4537 mg/kg·FW的亞硫酸鈉能有效抑制PPO的活性。在枇杷果實加工過程中應(yīng)根據(jù)具體情況選擇適當(dāng)?shù)奶幚頊囟龋ㄋ矔r熱燙），并通過改變pH或添加抑制劑等方法來達到抑制褐變的目的。

[1]Chang Y L,Kagan L V,Antoni W J.Enzymatic browning in relation to phenolic compounds and polyphenoloxidase activity among various peach cultivars[J].Agric Food Chem,1990,38:99-101

[2]Mayer A M,Harel E.Polyphenol oxidase in plants[J].Phytochem,1979,18:193-215

[3]鞠志國，朱廣廉，曹宗巽.萊陽茬梨果實褐變與多酚氧化酶及酚類物質(zhì)區(qū)域化分布的關(guān)系[J].植物生理學(xué)報，1988，14(4)：356-361

[4]鞠志國.萊陽茬梨細胞中多酚氧化酶的分布及其性質(zhì)[J].植物生理學(xué)通訊，1989(3)：33-35

[5]乜蘭春,孫建設(shè),辛蓓,等.蘋果果實酶促褐變底物及多酚氧化酶活性的研究[J].園藝學(xué)報,2004,31(4):502-504

[6]程建軍,馬鶯,楊詠麗,等.蘋果梨中多酚氧化酶酶學(xué)特性的研究[J].園藝學(xué)報,2002,29(3):261-262

[7]Yang C P,Fujita S,Kohno K,et al.Partial purification and characterization of polyphenol oxidase from banana （Musa Sapientum L.）peel[J].AgricFoodChem(S0021-8561),2001,49(3):1446-1449

[8]李曉莉,沈金玉,黃家音.山藥多酚氧化酶特性研究[J].精細化工,2005,22(7):527-529

[9]李寧,郁志芳,趙友興,等.蓮藕多酚氧化酶的酶學(xué)特性[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報,2002,18(1):63-64

[10]Duangmal K,Richard K,Apenten O.A Comparative Study of Polyphenoloxidases From Taro(Colocasia esculenta)and Potato(Solanum tuberosum var.Romano)[J].Food Chemistry(S0308-8146),1999,64(3):351-359

[11]YACKOISSET Dedmogane Guy,王璋.景紅桃和白花桃中多酚氧化酶性質(zhì)的研究[J].食品與機械,2005,21(2):23-26

[12]吳繼紅,蔡同一.新疆無核白葡萄多酚氧化酶特性的研究[J].食品工業(yè)科技,2003,24(4):35-37

[13]周堅,萬楚筠,沈汪洋.甜柿多酚氧化酶特性的研究及褐變控制[J].食品科學(xué),2005,26(1):60-63

[14]黃建韶,田宏現(xiàn).蓮藕中多酚氧化酶的性質(zhì)[J].吉首大學(xué)學(xué)報,2002,23(2):82-84

[15]袁江蘭,胡征,康旭,等.羊肚菌多酚氧化酶性質(zhì)的研究[J].食品科學(xué),2005,26(6):65-67

[16]王鏡巖,朱圣庚,徐長法.生物化學(xué)(上冊)[M].3版.北京:高等教育出版社,2002:355-360

[17]鮑金勇,趙國建,梁淑如.香蕉皮多酚氧化酶和過氧化物酶特性的研究[J].食品科技,2005(11):17-20

[18]鄭杰,馮作山,劉宗林,等.新疆阿魏菇多酚氧化酶特性研究[J].食品科學(xué),2005,26(3):56-59

[19]王璋.食品酶學(xué)[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,1992：266-268

Study on Characteristics of Polyphenoloxidase in Loquat

SHI Hui，ZHENG Yu-ping，RUAN Shao-jiang，CHEN Yong
（Department of Biology，Ningde Normal University，Ningde 352100，F(xiàn)ujian，China）

2009-08-24

寧德師范高等?？茖W(xué)校校級科研資助項目(2009202)

史輝(1979—)，男(漢)，講師，碩士，研究方向：果品保鮮與生物技術(shù)。