裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA研究進(jìn)展

魏 萍，馬小琛，任路靜，紀(jì)曉俊，何光華，劉 臻，黃 和，*

（1.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210009；2.浙江貝因美科工貿(mào)股份有限公司，浙江杭州310007）

裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA研究進(jìn)展

魏 萍1，馬小琛1，任路靜1，紀(jì)曉俊1，何光華2，劉 臻2，黃 和1，*

（1.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210009；2.浙江貝因美科工貿(mào)股份有限公司，浙江杭州310007）

DHA是一種重要的多不飽和脂肪酸，裂殖壺菌（Schizochytrium）因富含DHA成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。本文介紹了Schizochytrium及其合成DHA的代謝機(jī)理，并對(duì)國(guó)內(nèi)外Schizochytrium發(fā)酵生產(chǎn)DHA的水平、發(fā)酵底物、發(fā)酵工藝進(jìn)行綜述?；谀壳鞍l(fā)酵狀況，提出了DHA發(fā)酵過程中存在的問題，并指出選育高產(chǎn)穩(wěn)定菌株、對(duì)合成DHA代謝途徑及關(guān)鍵酶進(jìn)行研究、改進(jìn)合適的生物反應(yīng)器并進(jìn)一步應(yīng)用數(shù)學(xué)工具優(yōu)化發(fā)酵工藝是今后的研究重點(diǎn)。

裂殖壺菌，DHA，發(fā)酵

Abstract：DHA is an important polyunsaturated fatty acid.Schizochytrium has captured an international research hotspot because of its abundant content of DHA.In this article，Schizochytrium and its metabolic mechanism for DHA biosynthesis，the production level，fermentation substrates and fermentation technology were introduced.In view of the present research situation，the problems existed in DHA fermentation process were also mentioned.It is pointed out that the future research emphasis should be placed on screening high-yield and stable microbe strains，investigating the key enzymes involved in the lipid biosynthesis，designing an appropriate bioreactor for DHA production and using the mathematic tools to optimize the fermentation process.

Key words：Schizochytrium；DHA；fermentation

二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，簡(jiǎn)稱DHA）是重要的ω-3多不飽和脂肪酸，俗稱“腦黃金”，具有促進(jìn)腦細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、降血脂、降血糖、保護(hù)視力、抗癌及提高免疫能力等多種重要的生理功能，被譽(yù)為新一代功能保健因子，受到世人極大的關(guān)注。傳統(tǒng)深海魚油提取的DHA受魚的品種、季節(jié)及地理位置的影響而不穩(wěn)定，且膽固醇和其它不飽和脂肪酸含量高，導(dǎo)致DHA產(chǎn)量有限、分離純化困難，成本較高等問題。隨著魚油原料來源日漸緊缺，難以實(shí)現(xiàn)DHA這種高附加值產(chǎn)品在食品和醫(yī)藥等行業(yè)中的廣泛應(yīng)用。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)DHA可克服傳統(tǒng)魚油提取的不足，可用于大量生產(chǎn)DHA，不斷滿足人們的需求，具有廣闊的應(yīng)用前景，備受國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。能夠合成DHA的微生物主要是一些低等海洋真菌和微藻，如破囊壺菌（Thraustochytrium）、裂殖壺菌（Schizochytrium）、隱甲藻（Crythecodinium cohnii）等。而Schizochytrium因其生長(zhǎng)速度快、易于培養(yǎng)、細(xì)胞內(nèi)脂肪酸和DHA含量高等優(yōu)勢(shì)，具有更大的應(yīng)用價(jià)值，是目前進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)DHA的理想物種之一［1］。

1 裂殖壺菌概述

1.1 裂殖壺菌介紹

Schizochytrium又稱裂壺藻，屬于真菌門（Eumycota）、卵菌綱（ Oomycetes）、水霉目（Saprolegniales）、破囊壺菌科（Thraustochytriaceae）的一類類藻的海洋真菌，單細(xì)胞、球形。目前已有五個(gè)種被分離出，分別是：S.aggregatum、S.minutum、S.octosporum、 S.mangrovei 和 S.limacinum。Schizochytrium細(xì)胞積累大量對(duì)人體有用的活性物質(zhì)，如：油脂、色素（類胡蘿卜素、葉黃素、蝦青素等）、角鯊烯［2］等，其中油脂占細(xì)胞干重的70%以上，總脂肪酸中DHA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)35%～45%，且細(xì)胞中90%以上的油脂以人體易吸收的中性油脂——甘油三酯（TG）形式存在，還有的是以卵磷脂（PC）形式存在，如 1-棕櫚-2-DHA-PC 和 1，2-雙-DHA-PC［3］。

表1 國(guó)內(nèi)外代表機(jī)構(gòu)用Schizochytrium發(fā)酵產(chǎn)DHA水平概況

對(duì)于Schizochytrium的安全性評(píng)價(jià)，Hammond等人進(jìn)行了全面、詳細(xì)的研究，包括對(duì)大鼠的亞急性毒性實(shí)驗(yàn)［4］、對(duì)大鼠和兔子發(fā)育的毒性實(shí)驗(yàn)［5］、對(duì)大鼠生殖影響的實(shí)驗(yàn)［6］、對(duì)大鼠的誘變實(shí)驗(yàn)［7］以及對(duì)豬發(fā)育的安全性評(píng)價(jià)［8］，均未發(fā)現(xiàn)有任何毒副作用。且其安全性已得到美國(guó)食品藥品管理局局（Food and Drug Administration）的認(rèn)可，能開發(fā)醫(yī)藥、食品（尤其是孕婦、哺乳期婦女和兒童食品）以及飼料等系列產(chǎn)品。美國(guó)已經(jīng)批準(zhǔn)Schizochytrium為GRAS（Generally Recognised as safe）級(jí)營(yíng)養(yǎng)添加物，推薦的每日攝入量為1.5g。

1.2 裂殖壺菌合成DHA代謝機(jī)理

在生物體內(nèi)，長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的合成是一個(gè)碳鏈延長(zhǎng)和耗能的過程，需要物質(zhì)乙酰-CoA、不同種類的酶和NADPH提供的能量。其中乙酰-CoA不能直接穿出線粒體膜，主要通過胞漿中的檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)體系到達(dá)胞漿，經(jīng)檸檬酸裂解酶得到乙酰CoA和草酰乙酸。草酰乙酸在蘋果酸脫氫酶和蘋果酸脫梭酶的作用下，產(chǎn)生NADPH提供脂肪酸合成中所需要的還原力，產(chǎn)生的乙酰-CoA作為脂肪酸合成的起始物質(zhì)。在乙酰CoA和NADPH充足供應(yīng)的基礎(chǔ)上，長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸是如何合成的呢？絕大多數(shù)的微生物體內(nèi)多不飽和脂肪酸通常由單不飽和脂肪酸和脂肪酸油酸開始，并通過脂肪酸合成酶（FAS）和一系列去飽和酶催化完成。近年來，許多研究者發(fā)現(xiàn)Schizochytrium合成DHA存在新的途徑。Metz［9］等通過對(duì)Schizochytrium sp.ATCC20888多不飽和脂肪酸合成酶3個(gè)亞基的開放閱讀框?qū)Ρ确治鲆约?4C同位素標(biāo)記推斷：Schizochytrium極有可能通過聚酮合酶（PKS）催 化 合 成 DHA。Wallis［10］等 人 也 揭 示Schizochytrium體內(nèi)DHA生物合成不依賴碳鏈延長(zhǎng)與脫氫反應(yīng)，他們的研究成果進(jìn)一步揭示了DHA合成存在新的機(jī)制。2003年，Martek公司成功攻克了Schizochytrium中編碼PKS途徑中相關(guān)酶的基因序列［11］，并于2006 年對(duì) Schizochytrium sp.中長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸合成酶以及I型的脂肪酸合成酶進(jìn)行研究，提出在Schizochytrium sp.體中DHA和DPA只需由長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸合成酶合成，而短鏈的飽和脂肪酸（C14∶0和 C16∶0）主要通過 I 型的脂肪酸合成酶合成［12］。以上研究充分說明，Schizochytrium體內(nèi)DHA的合成過程并不涉及脂肪酸脫氫酶和去飽和酶催化過程，而是由PKS途徑合成。這一重要發(fā)現(xiàn)將為Schizochytrium產(chǎn)DHA的代謝調(diào)控研究提供新的思路和方法。但是對(duì)于DHA的具體合成機(jī)理仍不清楚，有待進(jìn)一步研究。

2 裂殖壺菌發(fā)酵DHA研究水平概述

八十年代初隨著人們對(duì)PUFAs生理作用認(rèn)識(shí)的加強(qiáng)，DHA的生物合成引起了人們的極大關(guān)注。國(guó)外對(duì)發(fā)酵產(chǎn)DHA的研究較早，且DHA的生產(chǎn)在日本和一些歐美國(guó)家已進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)階段。最早將Schizochytrium應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)的是美國(guó)的Omega生物技術(shù)公司。早在1991年，該公司就研究出了一套Schizochytrium的培養(yǎng)工藝，培養(yǎng)48h后，菌體的生物量可達(dá)20g/L，DHA達(dá)細(xì)胞干重的10%［13］。10多年前，Martek生物科技收購(gòu)了Omega生物技術(shù)公司，并已成功篩選出異養(yǎng)培養(yǎng)生產(chǎn)富含DHA的菌種，并在培養(yǎng)條件上進(jìn)行了深入探索，將DHA產(chǎn)量提升到40～45g/L［14］，并奠定了該公司在 DHA 生產(chǎn)市場(chǎng)的主導(dǎo)地位。近年來國(guó)內(nèi)一些科研機(jī)構(gòu)如廈門大學(xué)、浙江大學(xué)、南京工業(yè)大學(xué)等對(duì) Schizochytrium發(fā)酵產(chǎn)DHA進(jìn)行研究，見表1，并取得一定進(jìn)展，但產(chǎn)量和質(zhì)量均較國(guó)外尚有一定差距，導(dǎo)致很多化妝品及食品行業(yè)仍需要進(jìn)口的微膠囊DHA。

3 發(fā)酵底物

Schizochytrium生長(zhǎng)需要提供足夠的碳源和氮源。碳源和氮源的數(shù)量和來源對(duì)其合成DHA有重要的影響，見表2。Wu［23］等發(fā)現(xiàn)葡萄糖、果糖和甘油DHA生產(chǎn)是較適的碳源，而二糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、多糖和可溶性淀粉都適合Schizochytrium sp.S31細(xì)胞的生長(zhǎng)和脂質(zhì)的積累，但不適合DHA的生產(chǎn)。Schizochytrium較多地利用有機(jī)氮源，如酵母抽提液、谷氨酸、胰胨、玉米漿等，但 Nakaharal［24］發(fā)現(xiàn)，無機(jī)氮源（NH4）2SO4是玉米漿良好的替代源，且可以用來調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH。Ganuza［16］等采用分批發(fā)酵，在培養(yǎng)基中不斷通入NH3，該通入的NH3不僅使培養(yǎng)保持一定pH，還可以作為氮源，最終DHA含量高達(dá)15.75g/L。在所有底物中，葡萄糖和酵母提取液是最常用的碳源和有機(jī)氮源。近年來研究者開始利用一些廢料或粗糧作為底物，以期望達(dá)到廢物再利用、節(jié)約糧食和降低成本，如Chi［25］等利用生物柴油副產(chǎn)物甘油作為Schizochytrium limacinum的原料發(fā)酵產(chǎn)DHA，其生物量達(dá)22.1g/L，DHA產(chǎn)量達(dá)4.91g/L，結(jié)果表明，生物柴油副產(chǎn)物甘油是Schizochytrium生產(chǎn)DHA很好的原料。Yamasaki［26］等利用酒廠廢水作為原料，DHA的產(chǎn)量達(dá)3.4g/L。以上研究充分說明，Schizochytrium能利用廉價(jià)廢棄生物質(zhì)資源發(fā)酵生產(chǎn)DHA。雖然Schizochytrium使用有些底物時(shí)，DHA的產(chǎn)量并不高［30］，但為工業(yè)降低成本提供了新的研究思路和方向。

表2 不同發(fā)酵底物對(duì)Schizochytrium生產(chǎn)DHA的研究

4 發(fā)酵工藝

4.1 兩步發(fā)酵法

Schizochytrium培養(yǎng)分為細(xì)胞生長(zhǎng)/分裂階段和脂質(zhì)積累階段，學(xué)者們采用兩步發(fā)酵法即采用分批發(fā)酵培養(yǎng)和培養(yǎng)條件改變，從而實(shí)現(xiàn)其高密度發(fā)酵和油脂在體內(nèi)的大量積累。在細(xì)胞生長(zhǎng)/分裂階段需要提供足夠的營(yíng)養(yǎng)以滿足細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖的蛋白質(zhì)、核苷等的合成。氮源的限制是油脂合成啟動(dòng)的前提［30］，因此油脂積累階段應(yīng)適當(dāng)限制氮源。Schizochytrium是需氧異養(yǎng)微生物，但DHA是通過厭氧途徑PKS合成，因此氧氣控制也是兩步發(fā)酵中的關(guān)鍵因素，Bailey［14］等采用分批發(fā)酵方式培養(yǎng)Schizochytrium，在發(fā)酵過程中不斷添加玉米糖漿，保持糖的濃度為7g/L，并使用硫酸鈉作為主要的鈉鹽，且在細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)/分裂期保持氧氣濃度大于4%，而在脂質(zhì)積累期保持氧氣濃度低于3%，并限制氮源，僅發(fā)酵90～100h，生物量高達(dá)200g/L，總脂肪酸是生物量的40%，且 DHA 高達(dá) 40～45g/L。Chi［31］等也采用轉(zhuǎn)化溶氧法，在細(xì)胞數(shù)量生長(zhǎng)期控制溶氧為50%，在油脂積累期控制溶氧為10%，該兩步溶氧控制使Schizochytrium的生物量和DHA含量分別提高到 37.9g/L 和 6.56g/L。Jakobsen［32］等在油脂積累階段采用N，P限制和O2限制，生物量達(dá)到90～100g/L，相比無O2限制情況下，DHA占總脂肪酸含量由36%提高到52%。該兩步發(fā)酵法不僅適合ω-3多不飽和脂肪酸的生產(chǎn)，也適合其它單細(xì)胞油脂的生產(chǎn)。

4.2 代謝調(diào)控研究

國(guó)內(nèi)外對(duì)Schizochytrium的研究主要集中在菌種的誘變和篩選，發(fā)酵條件的優(yōu)化［15-19］，如：碳源、氮源、碳氮比、無機(jī)鹽、前體促進(jìn)物質(zhì)以及溶氧、pH等方面的研究。近年來，隨著對(duì)DHA合成機(jī)理進(jìn)一步地認(rèn)識(shí)，研究者開始對(duì)合成DHA的代謝調(diào)控進(jìn)行研究，并已經(jīng)取得初步進(jìn)展。2005年，已初步闡明了AMP脫氫酶、檸檬酸裂解酶、蘋果酸酶的活性變化與甘油三酯積累的活動(dòng)的關(guān)系［33］，其中蘋果酸酶是NADPH的提供者。脂肪酸合成的兩個(gè)關(guān)鍵物質(zhì)是乙酰-CoA和NADPH［30］，乙酰-CoA 是油脂合成的前體，NADPH為DHA的合成提供還原力，這兩種物質(zhì)的充足供應(yīng)是保證脂肪酸不斷積累的重要因素。本課題組前期在總脂快速積累期，強(qiáng)化了乙酰-CoA和NADPH的供給，并添加4g/L蘋果酸，DHA占總脂的含量由35%提高到60%［20］。此外，向培養(yǎng)基中加入小分子還可對(duì)脂肪酸的分布進(jìn)行調(diào)控，Schizochytrium合成的總脂肪酸中，其它脂肪酸尤其是十四烷酸（C14∶0）、軟脂酸（C16∶0）和二十二碳五烯酸（DPA）含量較高。Shirasaka［34］等向培養(yǎng)基中加入氰鈷胺后，奇數(shù)碳脂肪酸如十五烷酸（C15∶0）和十七烷酸（C17∶0）顯著降低；當(dāng)加入甲苯甲酸后，DPA含量顯著降低，并能顯著降低DPA/DHA的值。

5 研究展望

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展和DHA在食品和藥品等行業(yè)的應(yīng)用，人們對(duì)DHA的需求將不斷擴(kuò)大，通過Schizochytrium發(fā)酵產(chǎn)DHA具有深遠(yuǎn)的意義和市場(chǎng)應(yīng)用價(jià)值。目前基因工程和代謝工程對(duì)Schizochytrium基因改造和代謝途徑的分析，DHA的發(fā)酵生產(chǎn)確已取得一定的進(jìn)展，但使其大規(guī)?；a(chǎn)尚需不懈努力。Schizochytrium發(fā)酵生產(chǎn)DHA過程中存在細(xì)胞生長(zhǎng)不穩(wěn)定、細(xì)胞活力不高、油脂含量少及細(xì)胞代謝難以調(diào)控等難題。今后應(yīng)進(jìn)一步深入研究以下幾個(gè)方面：

重視高產(chǎn)DHA的Schizochytrium的選育。優(yōu)良的菌種是DHA高產(chǎn)的首要因素，如何才能培養(yǎng)出穩(wěn)定和油脂含量高的Schizochytrium是DHA高產(chǎn)的關(guān)鍵，因此需要加強(qiáng)多種方式選育和基因工程改良等方面的研究。特別是研究基于代謝途徑分析對(duì)DHA高產(chǎn)菌進(jìn)行選育，加強(qiáng)主代謝流、強(qiáng)化能量代謝著重選育生長(zhǎng)穩(wěn)定、活力高、細(xì)胞大小均一的DHA高產(chǎn)菌。

分析DHA的合成機(jī)理。進(jìn)一步深入地研究DHA的合成途徑、調(diào)節(jié)機(jī)制和酶的作用過程，尤其是加強(qiáng)對(duì)PKS途徑、合成DHA關(guān)鍵酶學(xué)性質(zhì)的研究，減少其它脂肪酸含量，定向指導(dǎo)DHA的高效合成。

改進(jìn)適合Schizochytrium發(fā)酵產(chǎn)長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸的新型生物反應(yīng)器。探索發(fā)酵罐培養(yǎng)條件，對(duì)發(fā)酵罐流體力學(xué)（CFD）進(jìn)行研究，在發(fā)酵過程進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析的基礎(chǔ)上利用數(shù)學(xué)工具優(yōu)化發(fā)酵過程，解決發(fā)酵過程中高黏度體系下氧傳遞、傳熱、傳質(zhì)慢等發(fā)酵瓶頸問題，以優(yōu)化發(fā)酵工藝，從而創(chuàng)造適合Schizochytrium的生長(zhǎng)及產(chǎn)油的環(huán)境。

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Research progress on DHA production by Schizochytrium

WEI Ping1，MA Xiao-chen1，REN Lu-jing1，JI Xiao-jun1，HE Guang-hua2，LIU Zhen2，HUANG He1，*
（1.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing 210009，China；2.Zhejiang Beingmate Science，Industry and Trade Co.，Ltd.，Hangzhou 310007，China）

TS201.3

A

1002-0306（2010）10-0398-05

2009-10-15 *通訊聯(lián)系人

魏萍（1985-），女，研究生，研究方向：DHA發(fā)酵。

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）（2007CB707805）；江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃（CX07s-032z）資助。