丁香葉黃酮的抑菌作用研究

常麗新，賈長紅，高 曼，王 倩

（河北理工大學化工與生物技術(shù)學院，河北唐山063009）

丁香葉黃酮的抑菌作用研究

常麗新，賈長紅，高 曼，王 倩

（河北理工大學化工與生物技術(shù)學院，河北唐山063009）

利用70%乙醇作為提取劑，采用微波法提取丁香葉黃酮，研究了丁香葉黃酮對白葡萄球菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌活性。結(jié)果表明：丁香葉黃酮對三種細菌均有較好的抑制作用，特別對大腸桿菌的抑制效果最好，其次是白葡萄球菌，對金黃色葡萄球菌的抑制效果略差；丁香葉黃酮提取液的用量為3mL時，對三種細菌均具有明顯的抑制作用，最低抑菌濃度為942.21!g/mL。pH小于10時具有明顯的抑菌活性，且熱穩(wěn)定性好。

丁香葉，黃酮，抑菌作用

Abstract：Using 70%（∨/∨%）ethanol as solvent，the favonoids of lilac leaves was extracted by micro-wave，and the antimicrobial effect of flavonoids on E.coli，S-taphylococcusaureus and S.albus was studied.The results showed that favonoids of lilac leaves could effectively inhibit the growth of bacteria，especially on E.coli，secondly S.albus，then S-taphylococcusaureus；when the extracting volume of favonoids was 3mL，antimicrobial effect was obvious，the antimicrobial minimum dosage acted as 942.21μg/mL.When the pH range of inhibiting bacteria was lower 10，the heat stability was good.

Key words：lilac leaves；favonoids；antimicrobial effect

丁香亦名丁子香、雞舌，為木犀科，丁香屬植物，在我國資源豐富，分布較廣。丁香有抗菌、消炎、抗病毒等功效，如可用紫丁香葉提取物治療菌痢以及急性黃疸型肝炎［1］。黃酮是存在于植物體內(nèi)一大類物質(zhì)，能夠有效清除體內(nèi)的自由基及毒素，預(yù)防、減少疾病的發(fā)生，還具有消炎、抗過敏、廣譜抗菌、抗病毒作用［2］。本研究以丁香葉為材料，利用70%乙醇作為提取劑，采用微波法提取黃酮，探討了丁香葉黃酮對三種細菌的抑制效果，為丁香的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

丁香葉 采集河北理工大學校園，將丁香葉先用自來水洗凈，再用蒸餾水洗2遍，用濾紙或紗布吸干水，于90℃殺酶 15min，在 60～65℃烘干至脆，粉碎，過篩，備用；大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（S-taphylococcusaureus）、白葡萄球菌（S.albus） 由華北煤炭醫(yī)學院提供；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

HSP200-恒溫生化培養(yǎng)箱 中國科學院武漢科學儀器廠；YXQG02型電熱式高壓蒸汽滅菌鍋 山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；8002型恒溫水浴鍋天津中環(huán)科技開發(fā)公司；752型紫外-可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；202-0臺式電熱干燥箱、電子天平 泰斯特儀器有限公司；WG700SL23-K6微波爐 格蘭仕；不銹鋼分析篩 浙江上虞市華豐五金儀器有限公司；微量移液器 大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 丁香葉黃酮提取液的制備

1.2.1.1 標準曲線的繪制 準確稱取蘆丁0.0250g于100mL容量瓶中，加80%乙醇溶解，定容。準確吸取0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0、16.0mL 于 50mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉1.5mL，混勻，放置6min，加入10%硝酸鋁1.5mL，混勻，放置6min，加4%氫氧化鈉20mL，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，放置15min。以蒸餾水為空白，在510nm下測定吸光度。而后以蘆丁含量（mg）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得直線回歸方程為：

1.2.1.2 丁香葉黃酮含量的測定 準確移取5mL提取液于50mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉1.5mL，混勻，放置6min，加入10%硝酸鋁1.5mL，混勻，放置6min，加4%氫氧化鈉20mL，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，放置15min。以蒸餾水為空白，于510nm處測定吸光度值，從工作曲線方程中查出黃酮，計算出總黃酮含量（g）。

表1 不同濃度丁香葉黃酮提取液的抑菌圈直徑（cm）

1.2.1.3 丁香葉黃酮的得率計算

丁香葉黃酮得率（%）=丁香葉黃酮含量/丁香葉重量×100%

1.2.1.4 丁香葉黃酮提取液的制備 稱取一定量的100目丁香葉粉末，按照固液比1∶40，加入一定體積70%乙醇溶液中，靜置1h，而后在微波爐低火下加熱1.5min，過濾后即得到原液，計算黃酮得率為3.77%，相當于原液中黃酮濃度為942.21!g/mL。丁香葉黃酮原液在實驗前經(jīng)針孔過濾器（0.22!m）除菌。

1.2.2 菌種的活化 從供試菌種管中分別挑取少許菌種接種于試管斜面培養(yǎng)基上，每一菌種重復(fù)5次，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24h。

1.2.3 菌懸液的制備 分別用接種環(huán)挑取1環(huán)菌體于50mL無菌生理鹽水中，在搖床上振搖培養(yǎng)制成菌懸液。

1.2.4 丁香葉黃酮提取物的抑菌實驗

1.2.4.1 不同濃度丁香葉黃酮提取液的配制 將丁香葉黃酮原液的濃度視為100%，采用二倍稀釋法［3］用無菌水配制成不同濃度的溶液，依次為100%、50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%、1.563%，分別相當于黃酮濃度為 942.21、471.11、235.55、117.78、58.89、29.44、14.72!g/mL。

幾年前，父親帶著李離入蜀，去看青衣江上的佛像。川人集合了數(shù)千工匠，花掉了四十余年的時間，將一座山峰雕成慈眉善目的如來立像，秋風秋雨中，釋迦牟尼的眉眼音容依稀已經(jīng)出現(xiàn)，工人們搭著梯子，腰上纏著麻繩，舉錘布鑿，敲打他厚實的耳垂，慢慢將佛祖由山嶺間喚醒。

1.2.4.2 抑菌圈直徑的測定 將濾紙用打孔器打成若干9mm圓片，高壓滅菌，備用。在超凈工作臺上，將滅菌后的培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中，每皿15mL，冷卻凝固后，用無菌移液管吸取0.2mL菌懸液，加入到上述培養(yǎng)皿，用刮鏟將菌懸液涂勻。將滅菌后的濾紙片浸入不同濃度丁香葉黃酮提取液中30min，用無菌鑷子取出，晾干，平鋪于上述培養(yǎng)皿上。每皿呈十字鋪4片，每個濃度重復(fù)3次。然后于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24h，觀察記錄細菌生長情況，用刻度尺測定抑菌圈直徑，每一菌種重復(fù)3次。同時做空白，即以無菌生理鹽水代替丁香葉黃酮提取液，其他操作均同上。

1.2.4.3 丁香葉黃酮提取液用量對抑菌效果的影響

首先向已滅菌的培養(yǎng)皿中分別加入2、3、4mL黃酮濃度為942.21!g/mL原液，然后倒入15mL已滅菌的培養(yǎng)基，混勻，冷卻凝固，用無菌移液管吸取0.1mL菌懸液，加入到上述培養(yǎng)皿，用刮鏟將菌液涂均。而后于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24h，觀察記錄細菌生長情況，以得出適宜的丁香葉黃酮提取液的用量。

1.2.4.4 最低抑菌濃度的測定 在培養(yǎng)皿中加入適量體積不同濃度的丁香葉黃酮提取液，然后倒入15mL培養(yǎng)基，混勻，冷卻凝固后，用無菌移液管吸取0.1mL菌懸液，加入到上述培養(yǎng)皿，用刮鏟將菌液涂勻，然后37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24h，觀察記錄細菌生長情況，每個濃度重復(fù)3次，每種一菌種重復(fù)3次。觀察記錄細菌生長情況，以不長菌的濃度為最低抑菌濃度。

1.2.4.5 pH對丁香葉黃酮提取物抑菌效果的影響在無菌條件下，分別取最低抑菌濃度的丁香葉黃酮提取液一定體積于無菌三角瓶中，用0.1mol/L氫氧化鈉和0.1mol/L鹽酸將最低抑菌濃度的黃酮溶液pH 調(diào)節(jié)為 2、4、6、8、10、12。

在培養(yǎng)皿中加入適量體積不同pH的最低抑菌濃度的溶液，然后倒入15mL培養(yǎng)基，混勻，冷卻凝固，用無菌移液管吸取0.1mL菌種液，加入上述培養(yǎng)皿中，用刮鏟將菌液涂勻，然后于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24h，觀察記錄細菌生長情況，每一pH重復(fù)3次，每一菌種重復(fù)3次。

分別取最低抑菌濃度的丁香葉黃酮提取液于無菌三角瓶中，瓶口蓋好保鮮膜，分別在 60、70、80、90、100℃水浴中加熱30min后取出，在無菌條件下冷卻至室溫。在培養(yǎng)皿中加入適量體積經(jīng)上述處理的最低抑菌濃度的黃酮提取液，然后倒入15mL細菌培養(yǎng)基，混勻，冷卻凝固，用無菌移液管吸取0.1mL菌懸液，加入到上述培養(yǎng)皿，用刮鏟將菌液涂勻，然后于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24h，觀察記錄細菌生長情況，每個溫度重復(fù)3次，每一菌種重復(fù)3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 濾紙片法測定抑菌效果

從表1中可以看出，隨丁香葉黃酮提取液濃度的降低，三種菌的抑菌圈直徑均逐漸變小。其中以濃度942.21!g/mL的抑菌圈直徑最大。從對三種菌的抑制效果看，對大腸桿菌的抑制效果最好，其次是白葡萄球菌，對金黃色葡萄球菌的抑制效果略差。

2.2 丁香葉黃酮提取液的用量對抑菌效果的影響

由表2可知，濃度為942.21!g/mL丁香葉黃酮提取液的用量不同，抑菌效果也不同。對于大腸桿菌，用量2、3、4mL均有明顯的抑制作用，無菌落生長；金黃色葡萄球菌、白葡萄球菌用量2mL時抑制作用不明顯，有少量菌落生長，用量3、4mL時有明顯的抑制作用，無菌落生長。因此丁香葉黃酮提取液的用量選擇3mL為宜。

表2 丁香葉黃酮提取液的用量對抑菌效果的影響

2.3 最低抑菌濃度的測定

最低抑菌濃度（MIC）是指能夠抑制培養(yǎng)基內(nèi)細菌生長的最低濃度。由表3可以得出，黃酮提取物濃度為942.21!g/mL時抑菌效果最明顯，無菌落生長。而隨著提取液黃酮濃度的降低，抑菌效果越來越不明顯，因此確定最低抑菌濃度為942.21!g/mL。

表3 不同濃度丁香葉黃酮提取物的抑菌效果

2.4 pH對丁香葉黃酮提取物抑菌效果的影響

由表4可看出，丁香葉黃酮提取物在pH≤10時，有明顯的抑菌效果，無菌落生長；pH為12時，抑菌效果不明顯，有少量菌生長。

表4 pH對丁香葉黃酮提取物抑菌效果的影響

2.5 溫度對丁香葉黃酮提取物抑菌效果的影響

從表5中可以看出，丁香葉黃酮提取物隨溫度的升高抑菌作用沒有改變，說明丁香葉黃酮提取物的抗熱性很強，性質(zhì)較穩(wěn)定。

表5 溫度對丁香葉黃酮提取物抑菌效果的影響

3 結(jié)論

以丁香葉為材料，利用70%乙醇作為提取劑，采用微波法提取黃酮，研究發(fā)現(xiàn)，丁香葉黃酮提取液對三種細菌均具有明顯的抑制作用，其中對大腸桿菌的抑制效果最好，其次是白葡萄球菌，對金色黃葡萄球菌的抑制效果略差；丁香葉黃酮提取液的用量為3mL時，對三種細菌均具有明顯的抑制作用，最低抑菌濃度為942.21!g/mL。其抑菌作用在pH≤10時，效果明顯，而且抑菌作用不受溫度的影響，熱穩(wěn)定性好。

［1］江蘇醫(yī)學院.中藥大辭典［M］.上海：上海人民出版社，1975：152-153.

［2］李云雁，宋光森.板栗殼提取物抑菌作用研究［J］.林產(chǎn)化學與工業(yè)，2004，24（4）：61-64.

［3］谷肄靜，王立娟.蒲公英總黃酮的提取及其抑菌性能［J］.東北林業(yè)大學學報，2007，35（8）：43-45.

Study on antimicrobial effect of flavonoids from lilac leaves

CHANG Li-xin，JIA Chang-hong，GAO Man，WANG Qian
（Chemical Engineering and Biotechnology College，Hebei Polytechnic University，Tangshan 063009，China）

TS201.2

A

1002-0306（2010）10-0126-03

2009-08-14

常麗新（1965-），女，教授，碩士生導師，研究方向：天然產(chǎn)物的研究與開發(fā)。