白地霉發(fā)酵蘋果渣的產(chǎn)香特點(diǎn)研究

朱 靜，師俊玲，劉拉平

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌712100）

白地霉發(fā)酵蘋果渣的產(chǎn)香特點(diǎn)研究

朱 靜，師俊玲*，劉拉平

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌712100）

［目的］研究了白地霉TF發(fā)酵新鮮蘋果渣和干蘋果渣的產(chǎn)香特點(diǎn)。［方法］以蘋果濃縮汁生產(chǎn)廠的新鮮蘋果渣和干燥蘋果渣為原料，接種白地霉TF，靜置固態(tài)培養(yǎng)7d后，用固相微萃取法氣相檢測發(fā)酵體系中的揮發(fā)性成分；對照為未接種但經(jīng)滅菌和相同條件培養(yǎng)后的蘋果渣。［結(jié)果］共檢出化合物86種，鑒定出化合物80種，其中，發(fā)酵前后新鮮果渣分別為31種和35種，發(fā)酵前后干果渣分別為32種和34種。未發(fā)酵蘋果渣中的揮發(fā)性物質(zhì)主要是酚、烷類及其它物質(zhì)和醛、酮、酸類，酯類含量不到總揮發(fā)性物質(zhì)的25%；發(fā)酵后蘋果渣中揮發(fā)性物質(zhì)中50%以上為酯類物質(zhì)，醛、酮、酸類相對含量不到15%。發(fā)酵后新鮮果渣的主體酯類為2-甲基丁酸丁酯、2-甲基丁酸甲酯、異丁酸甲酯和己酸甲酯，相對含量分別為12.00%、8.50%、6.68%和6.13%；主體醇類為苯乙醇，相對含量為2.28%；發(fā)酵后干蘋果渣中的主體酯類為4-癸烯酸甲酯、2-甲基丁酸甲酯、3-甲基丁酸甲酯和異丁酸甲酯，相對含量分別為10.40%、9.49%、6.16%和6.09%；主體醇類為苯乙醇，相對含量為4.19%。［結(jié)論］白地霉TF發(fā)酵能夠有效提高蘋果渣中呈香性酯類的種類和含量，以及苯乙醇的含量，減少醛、酮、酸、酚、烷類及其它物質(zhì)的種類和含量，改善蘋果渣的風(fēng)味。

白地霉，蘋果渣，香氣成分，GC/MS

Abstract：［Objective］The paper aimed at investigating the aroma products by a strain of Geotrichum candidum TF during solid-state fermentation in apple pomace［.Methods］Fresh and dried apple pomace from an apple juice producing industry was used as the materials in the study.The apple pomace were sterilized，inoculated and cultivated with G.candidum TF for 7d.After the cultivation，the volatile substances were analyzed with GC/MS.In the study，the apple pomace undertook same cultivation but not inoculated with G.candidum TF which was used as the contro［l.Results］Eighty six compounds were tested in total and 80 of them were identified，including 31 and 35 compounds in the unfermented fresh and dried apple pomace，respectively，and 32 and 34 compounds in the fermented fresh and dried apple pomace，respectively.Phenol，alkyl-，aldehyde，ketone and other compounds were the principal compounds in the volatile substances in the unfermented apple pomace，while ester took up less than 25%in the total volatile products.For the fermented apple pomace，ester took up more than 50%in the total volatile products，with less than 15%of alkyl-，aldehyde and ketone.In the fermented fresh apple pomace，the principal esters were 2-methyl-butanoic acid-hexyl ester，2-methyl-butanoic acid-methyl ester，propanoic acid-2-methyl-methyl ester and hexanoic acid-methyl ester，with relative content of 12.00%，8.50%，6.68%and 6.13%，respectively，and the principal-ol was phenylethyl alcohol with relative content of 2.28%.In the fermented dry apple pomace，the principal ester was 4-Decenoic acid-methyl ester，2-methyl-butanoic acid-methyl ester，3-methylbutanoic acid-methyl ester and 2-methyl-butanoic acid-methyl ester，with relative content of 10.40%，9.49%，6.16%and 6.09%，respectively，and the principal-ol was phenylethyl alcohol with relative content of 4.19%.［Conclusion］Fermentation with Geotrichum candidum TF could efficiently improve the kinds and contents of ester and content of flavor esters and contents of phenylethyl alcohol，and reduce the kinds and content of alkyl-，aldehyde，ketone，phenol，and other compounds，and thus improved the flavor of apple pomace.

Key words：Geotrichum candidum；apple pomace；aroma components；GC/MS

中國是世界上最大的蘋果生產(chǎn)國和蘋果濃縮汁出口國，產(chǎn)業(yè)規(guī)模居世界第一。中國的蘋果濃縮汁占有全球市場的50%左右，年產(chǎn)鮮果渣近300萬t，干果渣 50～60 萬 t［1］，除少量被用于制備果膠［2-5］、生產(chǎn)檸檬酸［6-8］、用作食用菌培養(yǎng)基質(zhì)［9-10］等加工以外，大部分被用作飼料。蘋果渣中富含碳水化合物等有機(jī)物質(zhì)［11-12］，但是氮素含量較低。為了提高蘋果渣等廢渣飼料的營養(yǎng)價(jià)值，人們曾嘗試通過微生物發(fā)酵的方法提高飼料中的蛋白含量［13-15］，均取得了良好的效果。白地霉是飼料生產(chǎn)中常用的微生物菌種之一，廣泛地存在于食品和環(huán)境中［16］，對培養(yǎng)基營養(yǎng)要求低、適應(yīng)性強(qiáng)、生長快、生產(chǎn)方法簡單、宜于工業(yè)化生產(chǎn)，是一種極具發(fā)展?jié)摿Φ墓I(yè)微生物［17-18］。白地霉菌種TF是前期研究中分離得到的一株能夠產(chǎn)生濃郁果香味的菌種。如果能夠?qū)⒃摼N的發(fā)酵與蘋果渣的綜合利用結(jié)合起來，則有望提高果渣飼料的風(fēng)味和蛋白含量，甚至有可能用于生物發(fā)酵法生產(chǎn)香味物質(zhì)，從而為天然香精的生產(chǎn)提供新途徑［19］。而且，與動(dòng)植物提取法相比，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)香味物質(zhì)還具有生產(chǎn)季節(jié)靈活、操作簡便、周期短等優(yōu)勢，具有廣闊的發(fā)展前景［20］。目前，白地霉發(fā)酵蘋果渣的研究主要集中在菌體蛋白的利用［13，21］，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白地霉發(fā)酵蘋果渣能夠有效提高果渣飲料的營養(yǎng)價(jià)值，但從未有人注意過產(chǎn)香的問題。王慶國等人［22］曾對兩株產(chǎn)果香白地霉在合成培養(yǎng)基上的產(chǎn)香特性進(jìn)行了初步分析，但有關(guān)白地霉在蘋果渣中的產(chǎn)香特性研究還未見報(bào)道。為此，本文擬對白地霉菌株TF在新鮮蘋果渣和干燥后蘋果渣上的產(chǎn)香特性進(jìn)行研究，以期為提高蘋果渣飼料的風(fēng)味和將其用于生產(chǎn)香氣成分提供理論依據(jù)，為蘋果渣的綜合利用提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮蘋果渣 當(dāng)天鮮榨蘋果渣，由陜西通達(dá)果汁集團(tuán)股份有限公司禮泉分公司提供，含水量為70%，取回后存放于-18℃冰箱中，臨用前取出；干燥蘋果渣 取上述蘋果渣，在60℃烘干48h，含水量為5.89%，備用；培養(yǎng)基制備 新鮮蘋果渣直接稱取30g，干燥后蘋果渣按照原料∶水=1∶2調(diào)和，然后稱取30g，上述果渣均裝于250mL三角瓶中，振蕩均勻后使其鋪平，厚度約2cm，然后在121℃下滅菌20min，用于接種；白地霉TF 由西北農(nóng)林科技大學(xué)食品學(xué)院食品生物工程實(shí)驗(yàn)室分離自蘋果園土壤，并由該實(shí)驗(yàn)室保藏和提供，使用前，將白地霉TF接入PDA（馬鈴薯葡萄糖瓊脂）培養(yǎng)基，30℃下靜置培養(yǎng)7d，用無菌水沖洗收集白地霉孢子，制備孢子懸浮液，經(jīng)血球計(jì)數(shù)板測定其中孢子濃度后，用無菌水調(diào)整孢子濃度為2.0×107個(gè)/mL，備用。

TRACE DSQ GC-MS聯(lián)用儀 美國Finnigan公司，配有DB-WAX（3m ×0.25mm ×0.25!m）彈性石英毛細(xì)管柱（美國Agilent公司產(chǎn)品）、手動(dòng)固相微萃取（SPME）進(jìn)樣器和50/30!m DVB/CAR/PDMS萃取頭（均為美國 Supelco公司）；ES-315全自動(dòng)高壓滅菌鍋 廣州東南科儀有限公司；SPX-300B生化培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；AIR TECH超凈工作臺(tái)蘇凈集團(tuán)安泰公司；HWS-380智能恒溫恒濕箱寧波海曙塞福實(shí)驗(yàn)儀器廠；氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀美國Finnigan公司；CS1013型電熱鼓風(fēng)干燥箱 重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠。

1.2 培養(yǎng)方法

在準(zhǔn)備好的蘋果渣培養(yǎng)基中，接入白地霉孢子懸浮液1mL，攪拌均勻后，在30℃（該菌的最適生長溫度）下靜置培養(yǎng)7d。培養(yǎng)的前2d用硅膠塞封口，培養(yǎng)第2d以后用封口膜封口。培養(yǎng)結(jié)束后，用GC/MS測定瓶中香氣成分的種類及其相對含量。對照為經(jīng)相同處理但不接菌的培養(yǎng)基。

1.3 揮發(fā)性氣體成分的分析

將培養(yǎng)好的樣品和對照樣放入30℃水浴中平衡10min；將老化好的固相微萃取器（在氣相色譜儀的進(jìn)樣口250℃老化1h）插在樣品瓶上，吸附40min后拔出，插入氣相色譜儀進(jìn)樣口，于250℃解析5min，進(jìn)行檢測。檢測條件為：程序升溫40℃，保持2.5min，以5℃/min升至200℃，再以10℃/min升至240℃，保持5min；進(jìn)樣口250℃；傳輸線230℃；載氣為氦氣，流速 1.0mL/min；不分流進(jìn)樣。電離方式 EI，70eV；離子源溫度250℃，質(zhì)量掃描范圍35～400amu；發(fā)射電流100!A，檢測電壓1.4kV。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

利用隨機(jī)Xcalibur工作站NIST2002標(biāo)準(zhǔn)譜庫自動(dòng)檢索各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)，參考文獻(xiàn)資料［23-24］及標(biāo)準(zhǔn)譜圖［25］對機(jī)檢結(jié)果進(jìn)行核對和確認(rèn)，按面積歸一化法計(jì)算各組分的含量。

2 結(jié)果與分析

實(shí)驗(yàn)共檢出化合物86種，根據(jù)NIST2002標(biāo)準(zhǔn)譜庫和參考文獻(xiàn)定性出的化合物80種（表1）。定性出的組分分別占發(fā)酵前后新鮮蘋果渣的94.96%和91.08%，發(fā)酵前后干蘋果渣的90.15%和91.94%。新鮮果渣和干燥果渣在發(fā)酵前后的GC/MS總離子色譜圖分別見圖1、圖3和圖2、圖4。

圖1 未發(fā)酵新鮮果渣中揮發(fā)性物質(zhì)的總離子流色譜圖

圖2 發(fā)酵后新鮮果渣中揮發(fā)性物質(zhì)的總離子流色譜圖

2.1 香氣成分的種類

新鮮果渣在發(fā)酵前后的檢出物分別為31種和35種，干燥果渣在發(fā)酵前后的檢出物分別為32種和34種。其中，2-甲基-丁酸丁酯、Glycine，N-［4-［trimethylsilyl）oxy］benzoyl］-，methyl ester、苯乙醇、丙炔酸、十四烷、十六烷是所有樣品中的共有物質(zhì)，丁酸甲酯和己酸己酯是新鮮果渣在發(fā)酵前后的共有酯類，但其相對含量在各樣品各不相同。除此以外，發(fā)酵前后的物質(zhì)種類各不相同。

表1 白地霉發(fā)酵蘋果渣所產(chǎn)主要香氣成分

續(xù)表

檢出的揮發(fā)性物質(zhì)主要為酯類、醛、酮、酸類、醇類、酚、烷類及其它物質(zhì)?？傮w而言，發(fā)酵前果渣中揮發(fā)性物質(zhì)主要是酚烷類，發(fā)酵后果渣中揮發(fā)性物質(zhì)主要是酯類；發(fā)酵過程增加了果渣中酯類的種類和含量，減少了醛、酮、酸類和酚、烷類等其它物質(zhì)的種類和含量，發(fā)酵后的果渣酯香濃郁。具體分析新鮮果渣和干果渣中各種揮發(fā)性物質(zhì)種類和相對含量的變化可見：a.酯類：發(fā)酵前分別為7種，22.85%和7種，16.12%；發(fā)酵后分別為20種，52.49%和20種，57.16%；b.醛、酮、酸類：發(fā)酵前分別為8種，19.22%和9種，35.66%；發(fā)酵后分別只有3種，1.43%和4種，12.47%；c.醇類：發(fā)酵前分別為3種，3.20%和3種，3.08%；發(fā)酵后分別只有1種，2.28%和1種，4.19%；d.酚、烷類其它物質(zhì)：發(fā)酵前分別為13種，49.69%和 13種，35.29%；發(fā)酵后分別為 9種，34.88%和9種，18.12%。

圖3 未發(fā)酵干果渣中揮發(fā)性物質(zhì)的總離子流色譜圖

圖4 發(fā)酵后干果渣中揮發(fā)性物質(zhì)的總離子流色譜圖

2.2 酯類物質(zhì)

酯類是發(fā)酵后果渣中揮發(fā)性物質(zhì)的主要成分。發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酯類均不同于果渣中原有酯類，未發(fā)酵的新鮮果渣和干果渣中的主體酯類分別是2-甲基丁酸丁酯（14.72%）和乙酸苯乙酯（5.18%）；發(fā)酵后新鮮果渣的主體酯類為2-甲基-丁酸丁酯、2-甲基-丁酸甲酯、異丁酸甲酯、己酸甲酯，其相對含量分別為12.00%、8.50%、6.68%、6.13%。發(fā)酵后干果渣的主體酯類為4-癸烯酸甲酯、2-甲基-丁酸甲酯、3-甲基-丁酸甲酯、異丁酸甲酯，其相對含量分別為10.40%、9.49%、6.16%、6.09%。發(fā)酵后新鮮果渣和干果渣中有15種酯類相同。不同酯類的呈香特性不同，在實(shí)際生產(chǎn)中可根據(jù)所需主要香型選用適宜的果渣的處理方式。

2.3 醇類物質(zhì)

發(fā)酵前新鮮果渣和干果渣中均有包括苯乙醇、正己醇在內(nèi)的3種醇類，發(fā)酵后果渣均只有苯乙醇一種醇類。分析可見，發(fā)酵過程去除了原果渣中的正己醇，增加了苯乙醇的相對含量。正己醇是一種高級醇類，含量過高具有一定毒性；苯乙醇則是香料用芳香化合物中較為重要和應(yīng)用廣泛的一種食用香料。因此，白地霉發(fā)酵蘋果渣可以提高果渣的風(fēng)味和食用安全性。

2.4 醛、酮、酸類物質(zhì)

除干果渣經(jīng)發(fā)酵后，丙炔酸含量有所增大以外，發(fā)酵過程去除了原果渣中的多種酸類。特別是，發(fā)酵后新鮮果渣中乙酸含量由原來的2.675降為0，發(fā)酵后干果渣中乙酸的含量由原來的10.32%降到0.90%。這說明，白地霉發(fā)酵蘋果渣的過程中，這些醛、酮、酸類物質(zhì)都進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，特別是原有的乙酸、己酸等都被完全轉(zhuǎn)化成了其它香氣成分，從而有效地提高了蘋果渣的風(fēng)味質(zhì)量。

2.5 酚、烷類及其它物質(zhì)

未發(fā)酵的蘋果渣中酚、烷類及其它物質(zhì)的種類繁多，占總揮發(fā)性物質(zhì)的40%以上，而且含有較多的C12～C17的烷烴類；發(fā)酵后而發(fā)酵后的新鮮果渣中只含有34.88%的這些物質(zhì)，發(fā)酵后干果渣中僅含有18.12%的這些物質(zhì)。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵后蘋果渣中均未檢出乙酸乙酯。龍明華在以濃縮蘋果汁為原料發(fā)酵生產(chǎn)的蘋果酒中也未檢出乙酸乙酯［23］。發(fā)酵后蘋果渣中檢出區(qū)別于對照中的酯類（2-甲基丁酸甲酯、己酸甲酯）和醇類（如苯乙醇）的含量都有明顯提高，說明在發(fā)酵的過程中產(chǎn)生了區(qū)別于未發(fā)酵蘋果渣中的特異性香氣且能夠使一些香氣物質(zhì)的含量有所提高，具體的機(jī)理和最適發(fā)酵條件還有待進(jìn)一步的研究。

由以上分析可以發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵前后蘋果渣中揮發(fā)性氣體的呈香特性具有顯著不同。發(fā)酵后蘋果渣中能夠產(chǎn)生大量具有果香，特別是蘋果香氣的呈香性物質(zhì)，從而說明了白地霉發(fā)酵可以有效提高蘋果渣的香氣濃度和香味種類，極大地提高了特征性香氣成分的含量，從而有望作為天然香精的基料。

研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后的蘋果渣中香氣物質(zhì)的種類和相對含量均高于未發(fā)酵的蘋果渣。這說明，白地霉發(fā)酵蘋果渣可以有效提高香氣物質(zhì)的種類和含量。與此類似，王慶國等［22］也曾發(fā)現(xiàn)兩株能夠產(chǎn)生果香物質(zhì)的白地霉XJB45和XJA58，它們在土豆汁葡萄糖培養(yǎng)基中產(chǎn)生的香氣成分主要是丁酸乙酯、異戊酸乙酯和丙酸丙酯、2-甲基-2-丁烯酸乙酯和惕各酸乙酯。而本文所得白地霉在蘋果渣中所得香氣成分則主要是2-甲基丙酸乙酯、乙酸乙酯和3-甲基-1-丁醇乙酸酯。造成這種差異的主要原因是研究用的微生物菌種、培養(yǎng)基和樣品處理方法不同。此外，王國慶等在分析前是用溶劑萃取法研究培養(yǎng)基中的香氣成分，而本文則是對所產(chǎn)氣體成分進(jìn)行直接檢測。這提示我們，白地霉發(fā)酵產(chǎn)香與培養(yǎng)基和菌種的種類有關(guān)。

本研究可為白地霉進(jìn)行香精或香料的生物合成提供基礎(chǔ)依據(jù)。香料和香精的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法、動(dòng)植物提取法和微生物發(fā)酵法。利用微生物發(fā)酵來模擬植物次級代謝過程可生產(chǎn)出香料化合物，而且這些香料化合物已被歐洲和美國食品法規(guī)界定為“天然的”［19］。隨著社會(huì)的發(fā)展和人們生活質(zhì)量的提高，人們對天然香料和香精的偏愛程度越來越高。而且與動(dòng)植物提取法相比，微生物發(fā)酵法具有不受季節(jié)影響、操作簡便、周期短等優(yōu)勢，具有廣闊的發(fā)展前景［20］。

白地霉發(fā)酵蘋果渣能夠有效提高果渣飼料的營養(yǎng)和風(fēng)味，提高飼料的適口性，研究為蘋果渣及其他農(nóng)產(chǎn)品廢料的利用提供了另一種途徑。白地霉中含有豐富的蛋白質(zhì)和脂肪，可供食用及飼用。國外廣泛用于生產(chǎn)乳酪［24-25］；國內(nèi)多用酒精廢水、豆腐廢水、豆腐酸漿、曲酒丟糟等廢棄物的發(fā)酵產(chǎn)生白地霉［26-29］，作為菌體蛋白使用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白地霉發(fā)酵蘋果渣消除了原有果渣中的異味。

發(fā)酵蘋果渣產(chǎn)生的香氣物質(zhì)組成復(fù)雜，且大多數(shù)組分含量很低，常規(guī)分析中應(yīng)用溶劑萃取濃縮等技術(shù)手段會(huì)使揮發(fā)性組分損失，因而揮發(fā)性物質(zhì)的檢測制約著香氣物質(zhì)的研究。本研究采用固相微萃取技術(shù)，減少了樣品處理環(huán)節(jié)且大量富集待測香氣組分，極大地提高了分析的靈敏度與準(zhǔn)確性［30］。

3.2 結(jié)論

本文研究了白地霉TF發(fā)酵蘋果渣所產(chǎn)香氣成分及其對蘋果渣風(fēng)味的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程能夠有效提高蘋果渣中酯類的種類和含量，增加果渣中苯乙醇含量，同時(shí)減少醛、酮、酸、酚、烷類及其它物質(zhì)的種類和含量，使蘋果渣產(chǎn)生濃郁果香，風(fēng)味得到很好的改善。

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Study on production of volatile aroma by solid-state fermentation of Geotrichum candidum in apple pomace

ZHU Jing，SHI Jun-ling*，LIU La-ping
（College of Food Science and Engineering，Northwest A&F University，Yangling 712100，China）

TS201.3

A

1002-0306（2010）10-0176-06

2009-08-03 *通訊聯(lián)系人

朱靜（1983-），女，在讀碩士研究生，主要從事食品生物技術(shù)研究。

現(xiàn)代葡萄產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（z225020804）；國家自然科學(xué)基金（20862014）。