平菇產(chǎn)木聚糖酶固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化和酶學(xué)性質(zhì)研究

吳 萍，周鳴鳴，盛 偉

（1.安徽科技學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽鳳陽233100；2.南通大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇南通226007）

平菇產(chǎn)木聚糖酶固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化和酶學(xué)性質(zhì)研究

吳 萍1，周鳴鳴2，盛 偉1

（1.安徽科技學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽鳳陽233100；2.南通大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇南通226007）

利用平菇（Pleurotus ostreatus）降解甘蔗渣固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶，通過單因素和正交實驗確定最佳培養(yǎng)基組分及其配比，并對其粗酶的酶學(xué)性質(zhì)進行了研究。結(jié)果表明：碳源為甘蔗渣8g∶玉米芯2g，氮源為2.0%酵母膏，pH為4，料水比為1∶3.2，裝瓶量為5g/125mL三角瓶，培養(yǎng)10d時，得到的酶活力最高，產(chǎn)酶量可達2918.95 U/g。粗酶液的最適反應(yīng)pH為5，最適反應(yīng)溫度為40℃，在pH4～6的范圍內(nèi)酶活性較穩(wěn)定。溫度的適應(yīng)性較寬，在30～70℃的范圍里，相對酶活仍保持在65%以上。

木聚糖酶，固態(tài)發(fā)酵，平菇，甘蔗渣

Abstract：The Pleurotus ostreatus was used to degrade bagasse for producing xylanase through solid-state fermentation.The optimum medium components and their ratio were determined by single factor and orthogonal tests and the crude enzyme properties was also studied.The results showed that carbon source included bagasse（8g）and corncob（2g），nitrogen source was 2.0%yeast extract，pH scale 4，feed water ratio 1∶3.2，bottling capacity 5g/125mL flask，for 10d culture.Under this condition，enzyme activity was the highest and its yields reach 2918.95U/g.The optimal reaction pH value was 5 for crude enzyme solution，the optimum reaction temperature 40℃，and the enzyme activity was more stable during the range of pH4～6.The temperature adaptability was wide and the relative enzyme activity remained over 65%in the range of 30～70℃.

Key words：xylanase；solid-state fermentation；Pleurotus ostreatus；bagasse

甘蔗渣作為一類大量存在的天然纖維質(zhì)和可再生利用的重要資源，受到越來越廣泛的重視。甘蔗渣中約含有30%的半纖維素，微生物產(chǎn)生的纖維素酶可以將其降解為單糖及少量寡糖［1］。木聚糖是半纖維素的一種重要組成成分，廣泛存在于各種植物資源中［2］。木聚糖酶是木聚糖的水解酶，它不僅在飼料、造紙、紡織、醫(yī)藥及能源等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景，而且在食品工業(yè)中也有很大的應(yīng)用價值。作為一種食品添加劑具有顯著的優(yōu)越性：首先，木聚糖酶本身是一種蛋白質(zhì)，既無毒又無害；其次，酶都具有高度的專一性和高效性，即使用目的性強且經(jīng)濟合算；而且木聚糖酶的酶促反應(yīng)條件溫和，從而可以有效地避免在食品加工中對營養(yǎng)成分帶來的損失［3-6］。本實驗試圖探討以廉價的甘蔗渣作為主要原料，添加其他輔料，利用安全且有很高營養(yǎng)價值的食用真菌—平菇進行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶，并對其固態(tài)發(fā)酵條件和酶學(xué)性質(zhì)進行了初步的探討。

1 材料與和方法

1.1 材料與儀器

平菇（Pleurotus ostreatus） 由安徽科技學(xué)院生物技術(shù)實驗中心提供；甘蔗渣 市場購入的新鮮甘蔗，去汁后，甘蔗渣置60℃烘箱內(nèi)烘干，用萬能粉碎機粉碎備用；3，5-二硝基水楊酸 中國醫(yī)藥集團上海試劑公司；燕麥木聚糖 Sigma公司；斜面培養(yǎng)基 馬鈴薯 200g，蛋白胨 20g，葡萄糖 20g，KH2PO41.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，VB1兩粒，瓊脂 18～20g，水1000mL，pH自然，在121℃下滅菌30min；液體種子培養(yǎng)基 馬鈴薯200g，葡萄糖20g，甘蔗渣2g，蛋白胨10g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 0.5g，水1000mL，pH自然，在121℃下滅菌30min；基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基 甘蔗渣 8g：麩皮 2g，硫酸銨 0.1g，KH2PO40.05g，MgSO40.05g，水30mL，pH 自然，在121℃下滅菌30min。

7230G可見分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；立式圓形壓力蒸汽滅菌器 上海醫(yī)用核子儀器廠；GL-20B高速離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；恒溫水浴鍋 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械廠；SW-CJ超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；微型粉碎機 天津泰斯特有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵過程

1.2.1.1 斜面菌種活化 將平菇菌種用無菌接種鏟鏟下2～3塊菌絲，接種于斜面培養(yǎng)基上，然后在25℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)5～7d。

1.2.1.2 液體種子的制備 將已活化的平菇菌種在無菌條件下，用事先準備好的無菌液體培養(yǎng)基分別洗下菌絲，將其倒入盛有80mL液體種子培養(yǎng)基的250mL三角燒瓶中，然后用八層紗布封口后，放入搖床內(nèi)，25℃，160r/min 培養(yǎng)5d。

1.2.1.3 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng) 將培養(yǎng)好的種子液按20%的接種量接入裝有5g固體基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的125mL的三角瓶中，然后放入培養(yǎng)箱內(nèi)，25℃培養(yǎng)10d。

1.2.2 不同發(fā)酵條件對產(chǎn)酶影響的實驗設(shè)計

1.2.2.1 碳源不同組分比的影響（g） 甘蔗渣10，甘蔗渣8∶玉米芯2，甘蔗渣6∶玉米芯2∶麩皮2。

1.2.2.2 不同氮源的影響（添加量均為培養(yǎng)基干料比的1%） 考察硝酸銨、酵母膏、牛肉膏、黃豆粉、玉米粉的影響。

1.2.2.3 不同起始 pH的影響 pH分別為4、5、6、7、8。

1.2.2.4 不同料水比的影響 1∶2.8、1∶3.2、1∶3.6、1∶4、1∶4.4。

1.2.2.5 不同裝料量的影響 在125mL的三角瓶中分別裝入培養(yǎng)基 3、5、7、9、11g。

1.2.2.6 不同培養(yǎng)天數(shù)的影響 7、8、9、10、11、12d。

1.2.3 產(chǎn)酶因素的正交實驗設(shè)計 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用L16（45）正交實驗對碳源、氮源、pH、料水比以及培養(yǎng)天數(shù)這5個產(chǎn)酶的因素進行優(yōu)化，因素水平表見表1。

表1 因素水平表

1.2.4 粗酶液制備及酶活測定

1.2.4.1 粗酶液制備 在固態(tài)發(fā)酵好的培養(yǎng)物中加入50mL 0.2mol/L pH4.8醋酸緩沖液，于40℃浸泡2h，過濾，再取濾液置于5mL離心管中，6000r/min離心15min，上清液即為粗酶液。

1.2.4.2 木聚糖酶活力測定（采用DNS法測定）［7-9］

取0.1mL上清液于15mL干燥刻度試管中，加入1.9mL 1%木聚糖溶液（pH4.8磷酸緩沖液配制），40℃水浴30min后，加入DNS試劑3.0mL。沸水浴5min，終止反應(yīng)并顯色。冷卻定容至15mL，搖勻。于520nm波長下測定吸光度，以100℃滅活粗酶液作對照。

酶活力單位定義為：在40℃每分鐘水解木聚糖形成相當(dāng)于1!g還原糖（以木糖計）所需的酶量（U/g），即：

木聚糖酶活力單位=NG/0.1×30

其中：N-酶液稀釋倍數(shù)；G-酶解溶液中木糖的含量，!g；0.1-加酶量；30-酶解時間，min。

1.2.5 木聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)的研究

1.2.5.1 木聚糖酶的最適pH 分別用pH3～8緩沖液配制的木聚糖溶液作為底物，加入0.1mL的酶液，然后在最適反應(yīng)溫度40℃下水浴30min后，加入DNS試劑3.0mL。沸水浴5min，終止反應(yīng)并顯色。冷卻定容至15mL，搖勻。空白對照中稀釋酶液在沸水浴中水浴15min使其失活，其它條件不變，測定其吸光度，計算其殘余木聚糖酶活力。

1.2.5.2 木聚糖酶的最適溫度 取0.1mL的酶液于15mL干燥刻度試管中，加入1.9mL 1%燕麥木聚糖溶液（pH4.8磷酸緩沖液配制），分別在30～80℃的水浴條件下反應(yīng)30min后，加入DNS試劑3.0mL。沸水浴5min，終止反應(yīng)并顯色。冷卻定容至15mL，搖勻?？瞻讓φ罩邢♂屆敢涸诜兴≈兴?5min使失活，其它條件不變，測定其吸光度，計算其殘余木聚糖酶活力。

1.2.5.3 木聚糖酶的pH穩(wěn)定性 用pH3～8的緩沖液稀釋酶液，在40℃水浴中保溫4h，然后分別取0.1mL稀釋過的酶液，并加入1.9mL 0.2mol/L用最佳反應(yīng)pH緩沖液配制的1%（W/V）木聚糖溶液，然后在最佳反應(yīng)溫度下水浴，酶解30min，加3mL DNS，沸水浴反應(yīng)5min，冷卻，定容至15mL混勻，于520nm處測其吸光度，未經(jīng)處理的酶定為100。測定其吸光度，計算其殘余木聚糖酶酶活力。

1.2.5.4 木聚糖酶的熱穩(wěn)定性 將粗酶液分別在30～80℃水浴中保溫1h，冷卻后，取0.1mL粗酶液加入1.9mL 0.2mol/L pH4.8醋酸緩沖液配制的1%木聚糖溶液，在最佳反應(yīng)溫度下水浴，酶解30min，加3mL DNS，沸水浴反應(yīng)5min，冷卻，定容至15mL混勻，于520nm處測其吸光度，未經(jīng)處理的酶定為100，計算其殘余木聚糖酶酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 固體發(fā)酵結(jié)果分析

2.1.1 碳源不同配比對產(chǎn)木聚糖酶的影響 在原料的選擇上，本著經(jīng)濟、易得的原則，選用了甘蔗渣作為主要原料，并對甘蔗渣的配比進行產(chǎn)酶實驗，結(jié)果見圖1。

圖1 碳源不同配比對產(chǎn)木聚糖酶的影響

由圖1可知，以甘蔗渣8g∶玉米芯2g的產(chǎn)酶水平最高，甘蔗渣6g∶玉米芯2g∶麩皮2g次之。很明顯單獨以甘蔗渣作為碳源的產(chǎn)酶活力沒有復(fù)合碳源好，但是甘蔗渣6g∶玉米芯2g∶麩皮2g產(chǎn)酶活力又沒有甘蔗渣8g∶玉米芯2g高，這可能是由于麩皮的加入，導(dǎo)致固體培養(yǎng)基的粘性程度變大，通透性降低，從而影響了菌株生長，所以酶活力以甘蔗渣8g∶玉米芯2g最佳。

2.1.2 不同氮源對產(chǎn)木聚糖酶的影響 在氮源的選擇上，分別以硝酸銨、酵母膏、牛肉膏、黃豆粉、玉米粉作為氮源來測定對產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 不同氮源對產(chǎn)木聚糖酶的影響

由圖2可知，幾種氮源對菌株產(chǎn)酶的影響不大，只是酵母膏略高于其它幾種氮源。從生產(chǎn)成本考慮，可選用黃豆粉或玉米粉作為氮源比較經(jīng)濟。

2.1.3 不同pH對產(chǎn)木聚糖酶的影響 pH對調(diào)節(jié)菌絲細胞內(nèi)酸堿平衡和分解培養(yǎng)料的營養(yǎng)物質(zhì)具有一定作用。配制不同初始pH，以研究固體培養(yǎng)基的初始pH對木聚糖酶活力的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 不同pH對產(chǎn)木聚糖酶的影響

由圖3可知，以pH為5時所產(chǎn)酶的活力最高，偏酸或偏堿都對酶活力的提高產(chǎn)生影響。這是因為pH不僅會影響到菌株細胞膜所帶的電荷，從而引起細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，而且還可以通過改變培養(yǎng)基中有機化合物的離子化作用程度，對細胞施加間接影響，改變某些化合物分子進入細胞的狀況，從而促進或抑制微生物的生長。

2.1.4 不同料水比對產(chǎn)木聚糖酶的影響 不同的料水比對產(chǎn)酶影響較大，因此對基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基進行加水比例實驗，結(jié)果見圖4。

圖4 不同料水比對產(chǎn)木聚糖酶的影響

由圖4可知，料水比為1∶3.2時所產(chǎn)酶活最高。如果水分太少培養(yǎng)基比較干燥，菌體的生長和酶活力提高均受到影響；如果水分過大，則供氧和散熱條件惡化，菌體生長緩慢，酶活力也不高。

2.1.5 不同裝料量對產(chǎn)木聚糖酶的影響 分別向125mL的三角燒瓶中裝入基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基3、5、7、9、11g，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10d，測定發(fā)酵產(chǎn)物的酶活力，結(jié)果見圖5。

圖5 不同裝瓶量對產(chǎn)木聚糖酶的影響

裝料量對產(chǎn)酶的影響主要表現(xiàn)在：裝料量過多，通風(fēng)不暢，供氧不足，微生物生長不好而影響產(chǎn)酶；裝料量過少，則基質(zhì)表面水分蒸發(fā)過快，影響微生物的生長和代謝，產(chǎn)酶量仍然不高。由圖5可知，裝瓶量為5g時，產(chǎn)酶活力達到最高，所以選擇裝料量為5g為宜。

2.1.6 不同培養(yǎng)天數(shù)對產(chǎn)木聚糖酶的影響 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中定量接入菌種，從培養(yǎng)7d開始測定酶活力，每天測定一次，結(jié)果見圖6。

圖6 不同培養(yǎng)天數(shù)對產(chǎn)木聚糖酶的影響

由圖6可知，固態(tài)發(fā)酵時間采用8d最好，其后依次減小。因為在培養(yǎng)初期，由于營養(yǎng)條件較好，菌絲生長旺盛，8d后酶活達到最大值。此后，隨著生長時間的延長，菌絲體逐漸老化，酶活力也逐漸呈下降趨勢。

2.2 產(chǎn)酶條件的正交優(yōu)化

產(chǎn)酶條件的正交實驗結(jié)果見表2。結(jié)果表明：16個處理中，產(chǎn)酶量各不相同，存在一定的差異。決定產(chǎn)酶量大小的影響因子依次是C＞A＞B＞D＞E；產(chǎn)酶條件的最優(yōu)因子組合為A1B4C1D2E4，即培養(yǎng)基中碳源為甘蔗渣8g∶玉米芯2g，氮源為2%酵母膏，pH為4，料水比為1∶3.2，最佳培養(yǎng)時間為10d。在此培養(yǎng)條件下得到的酶活力最高，產(chǎn)量可達2918.95U/g。

表2 正交實驗結(jié)果

2.3 木聚糖酶部分酶學(xué)性質(zhì)的研究

2.3.1 木聚糖酶的最適pH 按1.2.5.1方法進行實驗，結(jié)果見圖7。

圖7 pH對酶活力的影響

由圖7可知，該酶的最適反應(yīng)pH為5。偏酸偏堿時，酶的活性均有所減小。

2.3.2 木聚糖酶的最適溫度 按1.2.5.2方法進行實驗，結(jié)果見圖8。

圖8 溫度對酶活力的影響

由圖8可知，酶的最適反應(yīng)溫度為40℃，超過60℃以上時，酶的活力逐漸開始下降。

2.3.3 木聚糖酶的pH穩(wěn)定性 按1.2.5.3方法進行實驗，結(jié)果見圖9。

由圖9可知，該木聚糖酶在pH為5時酶的相對活力達到了100%，在pH4～6的范圍內(nèi)酶活性較穩(wěn)定。而且在pH4～8范圍內(nèi)酶活仍保留了50%以上，這可能與平菇合成的木聚糖酶系組成有關(guān)，表明該酶系中可能有多種組分存在，因此該酶具有一定的耐酸和耐堿能力。

圖9 木聚糖酶的pH穩(wěn)定性

2.3.4 木聚糖酶的熱穩(wěn)定性 按1.2.5.4方法進行實驗，結(jié)果見圖10。

圖10 木聚糖酶的熱穩(wěn)定性

由圖10可知，木聚糖酶在40℃時酶的相對活力是100%，而且在30～60℃的范圍內(nèi)，相對酶活仍保持在80%以上。因此，平菇木聚糖酶具有廣泛的耐熱能力，從而它的應(yīng)用范圍也更為廣泛。

3 結(jié)論

實驗結(jié)果表明，以甘蔗渣為主要原料，平菇產(chǎn)木聚糖酶的最佳固態(tài)發(fā)酵條件碳源為甘蔗渣8g∶玉米芯2g，氮源為2%酵母膏，pH 為4，料水比為1∶3.2，裝瓶量為5g/125mL三角瓶，最佳培養(yǎng)時間為10d，在此培養(yǎng)條件下得到的酶活力最高，產(chǎn)量可達2918.95U/g。

平菇產(chǎn)木聚糖酶的最適反應(yīng)pH為5，在pH4～8的范圍里該酶的活性變化不大，因此具有一定的耐酸和耐堿的能力；而最適溫度為40℃，溫度的適應(yīng)性較寬，在30～70℃的范圍里，相對酶活仍保持在65%以上。

4 討論

本實驗選用食用真菌——平菇在優(yōu)化條件下固態(tài)發(fā)酵甘蔗渣生產(chǎn)木聚糖酶其意義有兩個方面：一是用廉價的甘蔗渣作為主要原料，通過固態(tài)發(fā)酵，生產(chǎn)木聚糖酶，具有生產(chǎn)成本低、經(jīng)濟效益高和生產(chǎn)工藝簡單等特點；二是選擇食用真菌——平菇作為始菌，主要考慮到：人類長期具有飲食食用菌的習(xí)慣，用該菌株產(chǎn)生的木聚糖酶在食品工業(yè)上應(yīng)用非常安全；由于食用菌是腐生菌，它能夠利用各種廢棄物轉(zhuǎn)化為真菌生物體；食用菌能分泌水解性的胞外酶，將纖維素、半纖維素（木聚糖）等大分子物質(zhì)分解而利用［10］；國內(nèi)外報道產(chǎn)木聚糖酶的微生物大多是細菌、霉菌等，很少有利用平菇這種食用真菌作為產(chǎn)木聚糖酶菌株的來源進行研究的，因此采用平菇為初始菌來發(fā)酵甘蔗渣生產(chǎn)木聚糖酶在食品工業(yè)的應(yīng)用具有很好的前景。

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Study on enzymatic characteristics and solid-phase fermentation condition of xylanase from P/eurotus ostreatus

WU Ping1，ZHOU Ming-ming2，SHENG Wei1
（1.College of Life Science，Anhui Science and Technology University，F(xiàn)engyang 233100，China；2.College of Life Science，Nantong University，Nantong 226007，China）

TS201.2

A

1002-0306（2010）10-0168-05

2009-09-16

吳萍（1958-），女，副教授，主要從事微生物學(xué)教學(xué)與微生物發(fā)酵方面的研究。

安徽省教育廳自然科學(xué)基金資助（KJ2009B168Z）；安徽科技學(xué)院生物學(xué)重點建設(shè)學(xué)科項目資助（AKXK20102-1）。