酒精飲料中氨基甲酸乙酯檢測方法研究進展

梁新紅，趙瑞香，周全霞

(河南科技學院，河南新鄉(xiāng)453003)

酒精飲料中氨基甲酸乙酯檢測方法研究進展

梁新紅，趙瑞香，周全霞

(河南科技學院，河南新鄉(xiāng)453003)

氨基甲酸乙酯是一種多位點致癌物，酒精飲料中含有微量的氨基甲酸乙酯。概述了國內(nèi)外酒精飲料中檢測氨基甲酸乙酯含量的方法;闡述了檢測方法中的樣品前處理方法、質(zhì)譜檢測選擇性離子控制模式、檢測方法的國際合作研究及我國氨基甲酸乙酯檢測方法，并展望了未來該領域研究的發(fā)展趨勢。

酒精飲料，氨基甲酸乙酯，檢測方法

Abstract:Ethyl carbamate is a pluripotent carcinogen and the alcoholic beverages contain trace ethyl carbamate.Data on analytical methodology were summarized，and the sample preparation method，the selected ion monitoring mode(SIM)，international collaborative studies and development of analytical methodologies in China were reviewed.The view for the research in this field was also taken.

Key words:alcoholic beverages;ethyl carbamate;analysis methods

氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate，EC，又叫Urethane)是一種多位點致癌物，可導致肺癌、淋巴癌、肝癌和皮膚癌等疾病，并且乙醇對EC的致癌性有促進作用［1－2］。1985 年，加拿大的衛(wèi)生與預防部門(Health Protection Branch of Canada)對酒精飲料中EC含量規(guī)定了強制性限量標準。隨后，1988年，美國食品和藥品管理局(US FDA)、美國葡萄酒研究所和美國酒商協(xié)會制定了有關葡萄酒中EC含量的非強制性標準。FAO/WHO食品添加劑聯(lián)合專家委員會(JECFA)第64次會議建議，為了保障人類身體健康，應盡可能降低發(fā)酵飲料和食品中EC含量。為了降低酒精飲料中EC的含量，各國政府都在采取措施，其中簡便、快捷、準確的EC含量的檢測方法是其中最重要的內(nèi)容之一。本文對國內(nèi)外EC的檢測方法的研究進展加以綜述。

1 EC檢測方法概述

EC不易揮發(fā)，在水中的溶解度大約為2g/mL，在有機溶劑中溶解度稍低，蒸氣壓較高，這些特征使得在分析檢測酒精飲料中痕量EC時，樣品前處理過程會造成EC的損失。

從上世紀七十年代在發(fā)酵食品和飲料中發(fā)現(xiàn)EC以來，許多文獻報道了酒精飲料中EC的檢測方法，表1中列舉了1986年以來報道的酒精飲料中EC檢測的主要方法。從表中可以看出，樣品前處理方法及檢測方法都在不斷改進。萃取方法從液/液萃取(Liquid/liquid extraction，LLE)發(fā)展至固相萃取柱(Solid phase extraction，SPE)及至方便簡單的固相微萃取(Solid phase Microextration，SPME);從 1986年后，EC的氣相檢測開始以毛細管柱代替填充柱，EC的檢測器也從氣相檢測器發(fā)展至高靈敏度的GC/MS乃至靈敏度及精密度更高的GC/MS/MS。然而，隨著人們對發(fā)酵酒精飲料中EC含量的進一步重視，新的檢測方法也在不斷出現(xiàn)。Melo Abreu等［23］第一次報道了用HPLC－FLD檢測酒精飲料中EC的方法的可行性，但方法的準確度和精確度較低，特別是干紅、干白葡萄酒中EC檢測精確度的相對標準偏差在10.9%～74.6%，因此這種檢測方法并沒有得到推廣。隨后，Park等［24］報道了采用HPLC/MS/MS方法檢測醬油中EC的報道，精確度的相對標準偏差在1.1%～2.2%，但此方法所需設備儀器昂貴。Lachenmeier等［25］報道了用傅立葉變換紅外光譜儀(Fourier transform infrared，F(xiàn)TIR)對核果酒精飲料中的EC含量進行快速檢測的方法，但報道的方法僅適合于定性及半定量檢測。很顯然，隨著研究的深入，F(xiàn)TIR方法的靈敏度和精密度的進一步提高，F(xiàn)TIR方法必將是EC檢測快速、方便的一種檢測方法，但目前，這種快速檢測方法不能滿足酒精飲料中EC限量標準的測定要求?？傊?，從以上分析及表1可以得知，二十世紀九十年代以后，EC的檢測主要用的是GC/MS法，因此樣品的前處理方法在檢測中起著至關重要的作用。

表1 酒精飲料中EC檢測方法參考文獻列舉

2 樣品前處理方法

色譜樣品的前處理過程是一個耗時、繁瑣且容易引入分析測定誤差的過程，樣品制備方法的恰當與否直接關系到氣象色譜分析的成本、速度和實用性。酒精飲料中EC含量的檢測，酒樣的前處理關系到EC檢測的成功與否。近年來，用于食品和飲料中痕量成分分析的方法主要有液/液萃取、固相萃取、固相微萃取和固液萃取等。

2.1 液/液萃取(LLE)

LLE是一種傳統(tǒng)的樣品預處理技術(shù)，直至目前仍是最常用的樣品前處理方法。它是利用待測組分與樣品中的雜質(zhì)在互不相溶的兩種溶劑中的分配系數(shù)不同而實現(xiàn)樣品的純化。這種萃取方法操作簡單，無需特殊的設備，但也存在一些難以克服的缺點:操作煩瑣、費時長，且重復性差;產(chǎn)生乳化作用，使分析結(jié)果偏低;萃取劑消耗量大，這些有毒的有機溶劑不利于分析人員的身體健康，在萃取過程中以及之后的溶劑回收過程中會伴有嚴重的污染問題等［26］。

2.2 固相萃取(SPE)

SPE技術(shù)是基于液相色譜理論的一種分離純化方法。SPE柱的廣泛應用起始于1975年美國Waters公司首次將Sep－Pak投放市場，用以濃縮被測組分或除去有害物質(zhì)。

與傳統(tǒng)的LLE樣品前處理方法相比，SPE方法具有如下優(yōu)點［27］:速度較快，縮短了預處理時間;采用高效、高選擇性的吸附劑，大大減少有機溶劑的用量，降低了實驗成本，又減少了對環(huán)境的污染;不出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，更有效地將分析物與干擾組分分離，易獲得較為純凈的分析物，分析物的回收率大大增高;分析物的精密度和準確度大大提高;操作簡單，容易實現(xiàn)自動化。

由于酒精飲料成分復雜多樣，受到其香氣成分、多酚類物質(zhì)及其它成分的影響，使得在檢測過程中，樣品的前處理成為一個難點和熱點，固相萃取技術(shù)的迅速發(fā)展為酒精飲料成分的檢測提供了樣品前處理的技術(shù)基礎。

2.3 固相微萃取(SPME)

SPME是1990年初由加拿大Waterloo大學Pawliszyn等在SPE基礎上發(fā)展起來的樣品預處理技術(shù)，屬于非溶劑型選擇性萃取法。其操作原理與SPE近似，但是操作方法迥然不同。SPME有兩種萃取方式，一種是將萃取纖維直接暴露在樣品中的直接萃取法，適于分析氣體樣品和潔凈水樣中的有機化合物。另一種是將纖維暴露于樣品頂空中的頂空萃取法，廣泛適用于廢水、油脂、高分子量腐殖酸及固體樣品中揮發(fā)、半揮發(fā)性的有機化合物的分析［26］。EC是半揮發(fā)性有機化合物，文獻報道的SPME方法一般采用頂空萃取法［28］。

SPME完全不涉及有機溶劑，使萃取、預富集、進樣一次完成，減少了分析時間，且可以自動進樣;SPME適用于多種樣品，在分析揮發(fā)性與半揮發(fā)性有機物上更能顯示出其優(yōu)越性;近年來，SPME和氣相色譜聯(lián)用，與高靈敏度的檢測器如質(zhì)譜、電子捕獲檢測器、原子發(fā)射光譜檢測器結(jié)合，可使分析的檢出限達到μg/L～ng/L量級;與高效液相色譜和毛細管電泳結(jié)合也有一定進展［29］。

3 質(zhì)譜檢測器的選擇性離子控制模式(Selected ion monitoring，SIM)

由表1可以看出，自1986年以來，用于EC檢測的檢測器普遍使用質(zhì)譜的選擇性離子控制模式。在EC的總離子掃描質(zhì)譜中，特征離子為m/z62、74和89(圖 1)［10，16］。m/z89 為分子離子，碎片離子 m/z74(CH2=O+－CO－NH2)和 m/z62(C(OH)2=NH+2)都來自于“McLafferty+1”的重排反應(圖 2)［16］。因為空氣中的CO2也能離解成m/z44(O=C=N+H2)，因此，m/z44(O=C=N+H2)一般不作為EC分析的特征離子。m/z89、m/z74和特征離子m/z62是EC定量分析中用于SIM的三種離子。

由圖1可以看出，m/z62在三種離子中強度最大。m/z62是大多數(shù)非氮取代氨基甲酸類化合物的特征粒子(除去烷氧基鏈中不含β－氫的物質(zhì)，如氨基甲酸甲酯、氨基甲酸丙酯等)。因此選擇其作為EC的定量離子。雖然對于大多數(shù)烷氧基甲基酯來說，m/z74也是麥氏重排的碎片離子，但其干擾化學物質(zhì)較多，一般情況下，m/z74質(zhì)量色譜首先被判斷為丁二酸二乙酯，然后才是氨基甲酸乙酯。在m/z89處，EC的峰非常弱而不能作為EC的準確定量特征離子。因此，將m/z62作為葡萄酒中EC含量檢測的定量離子。在葡萄酒EC含量檢測時，一般用m/z62進行定量，如圖 3［10－11，16］，在 m/z62 處峰強度較大。(GC/MS:Thermo Trace GC ultra－DSQ，美國 Finnigam公司)

圖1 100μg/L EC標準品的質(zhì)譜圖

圖2 m/z 62的麥氏重排反應

4 EC檢測方法的回收率，檢出限和內(nèi)標

一般情況下，EC的回收率和樣品中EC的濃度、酒精飲料的類型以及所用的樣品處理和檢測方法有關。外標法的回收率較低，一般在60%～80%左右。內(nèi)標法的回收率較高，歐洲委員會和OIV規(guī)定酒精飲料中 EC的測定采用內(nèi)標法，回收率要求在90%～110%之間。所有報道的酒精飲料中EC檢測的檢出限為1～100μg/L。

有文獻報道的EC檢測中使用的內(nèi)標有氨基甲酸甲酯［13］、氨基甲酸丙酯［10］、氘化氨基甲酸乙酯［30］等，也有采用氨基甲酸丁酯、氨基甲酸叔丁酯作為內(nèi)標的報道［31］。歐洲委員會和OIV建議采用氨基甲酸丙酯作為檢測EC的內(nèi)標。

圖3 葡萄酒中EC含量為25μg/L的m/z62質(zhì)譜圖

5 檢測方法的國際合作研究

有兩篇文獻報道了酒精飲料中EC檢測的合作研究。Canas等［10］報道了來自于美國、日本、英國、荷蘭、瑞士和法國的17個實驗室的酒精飲料中EC檢測的合作研究。這項合作研究是根據(jù)AOAC制定的合作研究程序指南而設計的。合作研究采用的EC分析方法為a.一次性硅藻土萃取柱，以二氯甲烷作為萃取劑;b.GC/MS方法，選擇性離子控制模式檢測;c.以氨基甲酸丙酯(n－propyl carbamate，nPC)作為內(nèi)標。合作研究實驗室對蒸餾酒、加強葡萄酒和佐餐葡萄酒的6種酒樣進行了檢測，回收率在87%～93%。Melo Abreo等［23］報道了把 HPLC/FLD 和 GC/MS方法進行比較的國際間合作研究，其目的是強調(diào)HPLC/FLD方法用于EC檢測的可能性。合作研究是確定一種準確、可靠及可行的標準檢測方法的途徑，但適合當?shù)貙嶒炇壹胺治鰲l件的可行的、準確度和精密度高的檢測方法研究更為重要。

6 我國EC檢測方法的研究進展

我國對酒精飲料中EC的檢測也進行了研究。納新力等［32］報道了用薄層分析法測定酒精飲料中的EC，此方法可以對酒中EC進行定性及半定量分析，但不能滿足飲料酒中限量標準的測定要求。袁身淑［7］、周英田等［8］前處理采用 LLE 方法，檢測采用GC/MS方法檢測酒中的EC，提高了檢測方法的靈敏度，但其質(zhì)譜檢測分別采用的選擇離子為m/z62、74、77、123 和 m/z44、62、74，檢測時對 EC 的定性尚有一定的缺陷。馬婭萍等［13，26］先后采用二維色譜和多維色譜技術(shù)直接分離白酒中EC，定量測定分別采用NPD檢測器和質(zhì)譜檢測器。王利平等［15］報道了前處理采用無溶劑萃取的SPME法，檢測采用GC/MS的方法，選擇離子采用m/z62和74，采用的是外標定量法，檢測的準確度較低。吳平谷等［6］前處理采用100mg/5mL的Cle－SLE固相萃取小柱，萃取酒樣量為2mL，檢測采用GC/MS的方法，但處理酒樣量少，檢出限低。

1993年，我國頒布了出口蒸餾酒、黃酒中EC檢驗的行業(yè)標準(SN 0285－93)。此標準的萃取方法采用的LLE方法，并且檢測采用的是外標法，很顯然，隨著前處理和檢測方法的提高，此行業(yè)標準亟待改進。

根據(jù)以上分析，我國對酒精飲料特別是葡萄酒中EC含量的檢測方法尚待進一步研究。

7 展望

隨著各國政府對食品安全的重視，準確、快速的酒精飲料中EC含量檢測方法無疑是酒精飲料中EC檢測需要解決的重要內(nèi)容。因此，無損傷檢測方法及方便實用的試劑盒檢測方法是酒精飲料中EC含量檢測迫切需要解決的方法。這些方法的建立，必將對酒精飲料行業(yè)采取措施降低酒精飲料中EC含量有重大實踐意義。

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Development of analysis methods of ethyl carbamate in alcoholic beverages

LIANG Xin－h(huán)ong*，ZHAO Rui－xiang，ZHOU Quan－xia
(Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang 453003，China)

TS261.7

A

1002－0306(2010)08－0400－05

2009－07－15

梁新紅(1971－)，女，博士，副教授，研究方向:食品生物技術(shù)。

河南科技學院博士基金資助項目(8001);河南省高等學校青年骨干教師資助計劃項目［2008(2775)］。