發(fā)酵廢菌渣生產(chǎn)飼料蛋白的研究

吳 萍，尚 耘

(1.安徽科技學院生命科學學院，安徽鳳陽233100;2.嘉吉烯王生物工程(武漢)有限公司，湖北武漢430000)

發(fā)酵廢菌渣生產(chǎn)飼料蛋白的研究

吳 萍1，尚 耘2

(1.安徽科技學院生命科學學院，安徽鳳陽233100;2.嘉吉烯王生物工程(武漢)有限公司，湖北武漢430000)

將食用菌和酵母菌菌種進行優(yōu)化組合后，以不同成分的廢菌渣為培養(yǎng)基，采用單獨培養(yǎng)和混合培養(yǎng)技術生產(chǎn)飼料蛋白。結(jié)果表明，混合培養(yǎng)優(yōu)于單獨培養(yǎng)，金針菇與JM酵母菌混合培養(yǎng)的發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量提高了25.09%、粗灰分提高了1.16%、纖維素降低了20.08%，產(chǎn)物中具有活性較高的半纖維素酶、纖維素酶及淀粉酶。

廢菌渣，酵母菌，食用菌，飼料蛋白

Abstract:The optimized combinational edible fungi and yeast were cultured alone or mixed with different fungi residues component as culture medium to produce feeding protein.The results showed that the mixed culture group was better than alone one.The crude protein of Flammulina velutipes and JM yeast mix culture liquid increased 25.09%，crude ash increased 1.16%while fiber decreased 20.08%，at the same time，the hemicellulase，cellulase and amylase in product had high activities.

Key words:fungi residues;yeast;edible fungi;feeding－protein

我國是蛋白質(zhì)飼料資源短缺的國家，目前蛋白質(zhì)飼料年缺口約為1500萬 t。據(jù)預測2010年和2020年我國蛋白質(zhì)飼料資源需求分別為6000萬t和7200萬t［1］。我國要發(fā)展蛋白質(zhì)飼料工業(yè)必須走適合我國國情的道路，即選擇來源廣泛、價格低廉的原料及低成本的工藝來生產(chǎn)蛋白質(zhì)飼料。目前我國發(fā)酵工業(yè)的廢菌渣和糟渣類農(nóng)副產(chǎn)品下腳料以及廢棄物大多沒有充分利用，這不僅造成資源浪費，而且造成環(huán)境污染［2－9］。本實驗以食用菌生產(chǎn)過程中的廢菌渣為主要基質(zhì)，篩選適合分解利用廢菌渣的多種大型食用真菌和酵母菌，采用單獨培養(yǎng)和混菌共同發(fā)酵工藝來生產(chǎn)飼料蛋白，以實現(xiàn)廢棄物質(zhì)資源化和物資的循環(huán)再生，減少環(huán)境污染。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

酵母菌(JM、JM－1、JM－3、P21、P31、P41)、食用菌(白靈菇、金針菇、靈芝、平菇、杏鮑菇) 均由安徽科技學院生物技術實驗室保存;基料 食用菌生產(chǎn)過程中采集鮮菇后的廢菌渣，即玉米芯為基質(zhì)的廢菌渣，由本校食用菌研究所提供;斜面培養(yǎng)基 馬鈴薯培養(yǎng)基(加富 PDA):馬鈴薯200g，蛋白胨20g，葡萄糖 20g，KH2PO41.5g，MgSO4·7H2O 1.0g，瓊脂20g，水1000mL，pH自然，在121℃下，滅菌30min;液體種子培養(yǎng)基 馬鈴薯200g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，廢菌渣 2g，KH2PO41.5g，MgSO4·7H2O 1.0g，水 1000mL，pH自然，在121℃下，滅菌30min;固體發(fā)酵培養(yǎng)基廢菌渣培養(yǎng)基Ⅰ:廢菌渣50%，麩皮15%，大豆粉16%，玉米粉12%，(NH4)2SO46%，過磷酸鈣1%，pH自然，攪勻、裝瓶滅菌;廢菌渣培養(yǎng)基Ⅱ:廢菌渣80%，麩皮10%，大豆粉2%，玉米粉6%，(NH4)2SO41%，過磷酸鈣1%，pH自然，攪勻、裝瓶滅菌;廢菌渣培養(yǎng)基Ⅲ:廢菌渣100%，pH自然，攪勻、裝瓶滅菌。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

1.2.1.1 斜面菌種培養(yǎng) 將酵母菌和食用菌接種至新制的馬鈴薯(加富PDA)斜面培養(yǎng)基上，然后將酵母菌放于30℃恒溫條件下培養(yǎng)3d，將食用菌放于25℃恒溫條件下培養(yǎng)7d。

1.2.1.2 液體種子培養(yǎng) 用10mL種子液將已活化的斜面菌種分別洗下并接種到盛有80mL液體種子培養(yǎng)基的250mL三角燒瓶中，然后將酵母菌放于30℃、160r/min的恒溫搖床中培養(yǎng)3d，而將食用菌放于25℃、160r/min的恒溫搖床中培養(yǎng)5d。

1.2.1.3 固體發(fā)酵培養(yǎng) 將培養(yǎng)好的種子液按干料的20%接種量接入到已滅菌的廢菌渣為唯一底物的固體發(fā)酵培養(yǎng)基(5g/100mL三角燒瓶)中，酵母菌和食用菌分別置30℃和25℃恒溫箱中培養(yǎng)5d和7d。待培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)物置60℃烘箱中烘干至恒重，測各自的粗蛋白含量。

1.2.2 單菌株篩選 將11種菌株分別接種到已滅菌的廢菌渣為唯一底物的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，酵母菌和食用菌分別置30℃和25℃恒溫箱中培養(yǎng)5d和7d，以粗蛋白含量為檢測指標，在同種微生物之間進行比較，篩選出能較好利用培養(yǎng)基中廢菌渣的單株菌。

1.2.3 混合菌株篩選 將篩選到的酵母菌與食用菌按1∶1方式接種到已滅菌的廢菌渣為唯一底物的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，置28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d，從中篩選出最優(yōu)的混合菌株組合。

1.2.4 接種方式篩選 將篩選到的最優(yōu)菌株組合按1∶1方式先后接種到已滅菌的廢菌渣為唯一底物的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，置28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d，從而找到一種最佳混合接種方式的菌株組合。

1.2.5 不同培養(yǎng)基組分篩選 將所篩選到的優(yōu)勢菌株，通過單菌株、兩菌株混合或兩菌株先后接種方式分別接種到不同組分固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，置28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d。以粗蛋白含量為檢測指標，找出最佳培養(yǎng)基。

1.2.6 分析方法 粗蛋白含量的測定:微量凱氏定氮法［10］;半纖維酶酶活力測定:DNS 法［11］;纖維素酶酶活力測定:參考文獻［12］;淀粉酶酶活力測定:參考文獻［13］;灰分測定:參考文獻［14］;粗脂肪含量的測定:參考文獻［14］;粗纖維的測定:參考文獻［14］。

2 結(jié)果與分析

2.1 單菌株的結(jié)果分析

2.1.1 酵母菌單菌株結(jié)果分析 對不同酵母菌單菌株發(fā)酵后的產(chǎn)物進行粗蛋白質(zhì)含量的測定，結(jié)果如圖1所示。

圖1 酵母菌單菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量

由圖1可知，幾種酵母菌均可提高發(fā)酵產(chǎn)物中的粗蛋白質(zhì)含量，其中JM、JM－1對廢菌渣的利用能力最好，產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)含量高于其它4種酵母菌。

2.1.2 食用菌單菌株結(jié)果分析 對不同食用菌單菌株發(fā)酵后的產(chǎn)物進行粗蛋白質(zhì)含量的測定，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，金針菇、靈芝產(chǎn)粗蛋白的含量要高于其它3種食用菌。這可能是由于金針菇、靈芝更能充分利用廢菌渣中營養(yǎng)，將其轉(zhuǎn)化為自身所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，從而獲得較高的菌體蛋白。

圖2 食用菌單菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量

2.2 混合菌株結(jié)果分析

將篩選到的2株酵母菌(JM、JM－1)與2株食用菌(金針菇、靈芝)相互配伍，可得到4對組合，即靈芝+JM、金針菇+JM、靈芝+JM－1和金針菇+JM－1。每種組合按1∶1混合接種，然后對發(fā)酵產(chǎn)物進行粗蛋白含量的測定，結(jié)果如圖3所示。

圖3 混合菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)含量

由圖3可知，金針菇與JM混合接種時，所得到的發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量最高。這可能與混合發(fā)酵中的食用菌能分泌大量的纖維素酶類有關，從而將發(fā)酵原料中的多糖物質(zhì)分解，分解的物質(zhì)除了可以保障自身生長外，還可以為酵母生長提供營養(yǎng)，促進其生長。

2.3 接種方式結(jié)果分析

對篩選到的2株酵母菌(JM、JM－1)與2株食用菌(金針菇、靈芝)相互配伍，可得到4對組合，即靈芝+JM、金針菇+JM、靈芝+JM－1和金針菇+JM－1。隨后各組都采用先接種食用菌培養(yǎng)3d后，再接種酵母菌培養(yǎng)4d方式進行實驗，然后檢測發(fā)酵產(chǎn)物中的粗蛋白含量，結(jié)果如圖4所示。

圖4 接種方式的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)含量

由圖4可知，金針菇與JM先后混合接種所得到的發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量最高。

2.4 培養(yǎng)基組分對發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)含量的影響

2.4.1 單菌株在不同培養(yǎng)基組分上發(fā)酵對產(chǎn)物中粗蛋白含量的影響 將篩選到的金針菇、JM兩優(yōu)勢菌株分別接種到培養(yǎng)基Ⅰ、培養(yǎng)基Ⅱ和培養(yǎng)基Ⅲ上進行單菌株發(fā)酵實驗，然后檢測發(fā)酵產(chǎn)物中的粗蛋白含量，結(jié)果如表1所示。

表1 在不同培養(yǎng)基上單菌發(fā)酵后產(chǎn)物中粗蛋白含量對比

由表1可知，兩菌株在培養(yǎng)基Ⅰ上發(fā)酵產(chǎn)粗蛋白產(chǎn)量相對最高，在培養(yǎng)基Ⅱ上產(chǎn)粗蛋白產(chǎn)量相對次之，而在培養(yǎng)基Ⅲ上產(chǎn)粗蛋白產(chǎn)量相對最少;說明培養(yǎng)基Ⅰ營養(yǎng)成分非常適合兩菌株生長。

2.4.2 混合菌株在不同培養(yǎng)基上發(fā)酵對產(chǎn)物中粗蛋白含量的影響 將篩選到的金針菇、JM兩菌株按1∶1混合接種到培養(yǎng)基Ⅰ、培養(yǎng)基Ⅱ和培養(yǎng)基Ⅲ上進行混合發(fā)酵實驗，然后檢測發(fā)酵產(chǎn)物中的粗蛋白含量，結(jié)果如表2所示。

表2 在不同培養(yǎng)基上混合接種發(fā)酵后產(chǎn)物中粗蛋白含量對比

由表2可知，混合菌株在三種培養(yǎng)基上產(chǎn)物中粗蛋白含量大小次序為:培養(yǎng)基Ⅰ＞培養(yǎng)基Ⅱ＞培養(yǎng)基Ⅲ。說明培養(yǎng)基Ⅰ的營養(yǎng)豐富，很適合菌株的生長。

2.4.3 先后混合接種在不同培養(yǎng)基上發(fā)酵對產(chǎn)物中粗蛋白含量的影響 將篩選到得金針菇和JM二個菌株按1∶1先后混合接種到培養(yǎng)基Ⅰ、培養(yǎng)基Ⅱ和培養(yǎng)基Ⅲ上進行混合發(fā)酵實驗，然后檢測發(fā)酵產(chǎn)物中的粗蛋白含量，結(jié)果如表3所示。

表3 在不同培養(yǎng)基上先后混合接種發(fā)酵后產(chǎn)物中粗蛋白含量對比

由表3可以看出，接種在培養(yǎng)基Ⅰ上的產(chǎn)物中的粗蛋白質(zhì)含量最高。

2.5 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物部分營養(yǎng)成分的測定

用篩選到的最佳培養(yǎng)基Ⅰ和最優(yōu)混合先后接種方式進行固態(tài)發(fā)酵，隨后對發(fā)酵產(chǎn)物中的各種酶活性(半纖維素酶、纖維素酶及淀粉酶)以及粗纖維、粗脂肪、灰分及粗蛋白含量進行測定。

2.5.1 發(fā)酵產(chǎn)物的成分分析 結(jié)果見表4。

由4表可以看出，發(fā)酵產(chǎn)物中的各種成分都得到了優(yōu)化。其中粗蛋白含量提高了25.09%，粗灰分提高了1.16%，粗纖維含量降低了20.08%，粗脂肪含量降低了3.54%。

表4 發(fā)酵產(chǎn)物及廢菌渣的成分分析

2.5.2 發(fā)酵產(chǎn)物中各種酶含量分析 按材料和方法中所述，對發(fā)酵產(chǎn)物中半纖維素酶、纖維素酶及淀粉酶等含量進行了分析，結(jié)果表明，每克發(fā)酵產(chǎn)物中含2000U半纖維素酶、1119U纖維素酶及1706U淀粉酶。產(chǎn)物中各種酶活性較高。

3 討論

3.1 本實驗所用的發(fā)酵原料為食用菌生產(chǎn)過程中的廢菌渣，廢菌渣用途廣泛，既可直接作為家畜的飼用，亦可用作肥料等。但是由于廢菌渣中粗纖維含量較高，若用作雞、豬等禽畜飼料，還需作進一步的發(fā)酵處理，因而可通過生物發(fā)酵技術來提高廢菌渣蛋白質(zhì)含量，從而達到蛋白精料的要求。

3.2 本實驗所用的發(fā)酵菌種為酵母菌和食用菌，它們是一類經(jīng)常用于商業(yè)生產(chǎn)的菌種，因而用來生產(chǎn)飼料十分安全。實驗結(jié)果表明，采用混合菌株發(fā)酵優(yōu)于單菌株發(fā)酵，其原因是混菌發(fā)酵促進了廢菌渣原料中纖維素的分解，形成了食用菌和酵母菌間的互惠共生關系，極大地提高了纖維素酶類對纖維素等多糖分解的能力，為酵母菌提供了可利用的還原糖和更好的生長環(huán)境，從而產(chǎn)生更多的菌體蛋白。

3.3 培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分對菌體生長及蛋白質(zhì)的含量有較大的影響，當菌種在培養(yǎng)基Ⅰ上生長時，其菌株的生長和蛋白含量都比較好。這是因為微生物只有在最適應的培養(yǎng)基上才能生長良好，而培養(yǎng)基Ⅰ滿足了該菌株對各類營養(yǎng)的需求。從3種培養(yǎng)基組分看，培養(yǎng)基Ⅰ的營養(yǎng)最為豐富，除含有廢菌渣以外，還含有一定量的麩皮、大豆粉、玉米粉、(NH4)2SO4、過磷酸鈣等成分，并且各營養(yǎng)的含量和配比都比較合適。

3.4 本研究集環(huán)保、廢物利用和飼料資源新產(chǎn)品開發(fā)為一體，通過微生物的發(fā)酵來實現(xiàn)廢物資源化，促進資源的多層次利用，改善生態(tài)系統(tǒng)循環(huán)，又能避免飼料養(yǎng)殖業(yè)普遍面臨的飼料蛋白質(zhì)資源不足、原料成本過高的問題。這在當前飼料缺口大，特別是蛋白質(zhì)飼料資源短缺，每年需大量進口的情況下，開辟了新的飼料來源。

4 結(jié)論

本實驗以廢菌渣為主要原料，添加其它輔料，通過對食用菌和酵母菌菌種的優(yōu)化組合，采用單獨培養(yǎng)和混合培養(yǎng)技術對在不同組分的廢菌渣培養(yǎng)基上生產(chǎn)的飼料蛋白進行了研究。結(jié)果表明，混合培養(yǎng)優(yōu)于單獨培養(yǎng)，其中以金針菇與JM酵母菌先后混合培養(yǎng)在廢菌渣培養(yǎng)基Ⅰ上，發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量提高了25.09%、粗灰分提高了1.16%、纖維素降低了20.08%，產(chǎn)物中具有較高活性的半纖維素酶、纖維素酶及淀粉酶。

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Study on feeding－protein producing with fungi residues

WU Ping1，SHANG Yun2
(1.College of Life Science，Anhui Science and Technology University，F(xiàn)engyang 233100，China;2.Cagill－Alking Bioengineering(Wuhan)CO.，Ltd.，Wuhan 430000，China)

TS201.2+1

A

1002－0306(2010)08－0129－04

2010－04－26

吳萍(1958－)，女，本科，副教授，研究方向:微生物學教學與微生物發(fā)酵。

安徽省教育廳自然科學基金資助(KJ2009B168Z)。