磁性殼聚糖微球固定化β-呋喃果糖苷酶的研究

許牡丹，曾令軍，姚甲玉，劉紅梅

(陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安710021)

磁性殼聚糖微球固定化β-呋喃果糖苷酶的研究

許牡丹，曾令軍，姚甲玉，劉紅梅

(陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安710021)

以磁性殼聚糖微球為載體，采用戊二醛交聯(lián)法固定化β－呋喃果糖苷酶，并對固定化酶的理化性質(zhì)等進(jìn)行了研究。結(jié)果表明:固定化β－呋喃果糖苷酶與游離酶相比，具有較強(qiáng)的耐堿性，在溫度低于70℃范圍內(nèi)有良好的熱穩(wěn)定性;固定化酶在4℃下保存15d后，剩余酶活力為80%左右，具有良好的儲存穩(wěn)定性，連續(xù)10次操作使用后保持50%的酶活，具有良好的操作性，固定化酶回收率為26%。

磁性殼聚糖微球，β－呋喃果糖苷酶，固定化酶

Abstract:β－fructofuranosidase was immobilized by cross linking with glutaraldehyde onto magnetic polyvinylalcohol microsphere.And the physical and chemical properties of the immobilized enzyme were studied.The results showed that the immobilized β－fructofuranosidase had stronger resistance to alkali compared with the free enzyme.In less than 70℃ situation，the immobilized β－fructofuranosidase showed good thermal stability.The recovery activity was 80%when the immobilized β－fructofuranosidase was stored at 4℃ for 15d.The recovery activity of the immobilized β －fructofuranosidase was more than 50% after repeated use for 10 times and immobilized enzyme recovery was 26%.

Key words:magnetic chitosan microspheres;β－fructofuranosidase;immobilization enzyme

殼聚糖(CTS)是自然界存在的唯一堿性多糖，可由蟹、蝦殼中的甲殼素經(jīng)脫乙?；磻?yīng)而制得。其資源豐富，安全無毒，具有獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)和易于化學(xué)修飾、生物可相容性和可再生性等功能。它的胺基極易形成四級胺正離子，可與弱堿性陰離子交換。β－呋喃果糖苷酶是一種廣泛存在于植物和微生物中的蔗糖苷酶［1］，工業(yè)上利用β－呋喃果糖苷酶生產(chǎn)低聚乳果糖，在pH4～8穩(wěn)定，最適pH為5.5，最適溫度為50℃，在55℃以下穩(wěn)定［2］。盡管β－呋喃果糖苷酶本身穩(wěn)定，但是容易受環(huán)境的種種不利因素影響而喪失活性。并且，很難使酶從反應(yīng)體系中回收利用。酶固定化是一種能夠使酶重復(fù)利用的技術(shù)，但目前對于β－呋喃果糖苷酶磁性殼聚糖微球固定化技術(shù)的研究報道很少。殼聚糖具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，可抵御化學(xué)降解以及可阻止金屬離子對于酶的干擾以及抑菌等，從而被認(rèn)為是一種良好的酶固定材料［3－4］。最近幾年磁性微球技術(shù)已是固定化酶的研究熱點(diǎn)，而殼聚糖可以作為磁性微球固定技術(shù)的磁性載體，可以大大改善酶的催化效率和酶的回收率。本文用殼聚糖磁性微球制備了β－呋喃果糖苷酶固定酶，并對其理化性質(zhì)進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

殼聚糖 浙江玉溪，脫乙酰度為90%，粘度為70mPa·s;粗酶液 本實驗室提供;Fe3O4實驗室自制;磁鐵 實驗室自備。

DA－8002型電子恒溫水域鍋 北京市化玻聯(lián)醫(yī)療器械有限公司;501型超級恒溫水域鍋 上海儀器實驗總廠;722型分光光度計 上海第三分析儀器廠;FA2004電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;冰箱。

1.2 實驗方法

1.2.1 磁性殼聚糖微球的制備［5］將2mL磁流體、20mL 2%的殼聚糖溶液(用3%乙酸溶液配制)、80mL液體石蠟、3mL Span－80加入2mL吐溫－80、20mL異丙醇的250mL錐形瓶中，超聲10min，迅速加入4mL 20%戊二醛，調(diào)pH至9.0，反應(yīng)2h，分別用異丙醇、乙醚、丙酮和水充分洗滌后，凍干，用磁鐵將產(chǎn)物分離，得到磁性殼聚糖微球。

1.2.2 磁性微球固定化β－呋喃果糖苷酶的制備50mg磁性殼聚糖微球，加入5mL粗酶液(0.1mol/L，pH7)，30℃緩慢攪拌1h，在4℃靜置2h，倒掉上清液，用pH7的磷酸鹽緩沖液反復(fù)洗滌，抽濾，得到的固定化酶在4℃下保存。

1.2.3 固定化酶酶活力檢測方法 稱取50mg固定化的β－呋喃果糖苷酶，于1mL混合糖液(由20%蔗糖和40%木糖溶于pH6.5的磷酸緩沖液制成)混合，40℃保溫10min，再于100℃加熱10min，產(chǎn)生的葡萄糖含量用葡萄糖試劑盒測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化酶的最適溫度

在不同溫度下測得固定化酶活力變化如圖1。

圖1 固定化酶的最適反應(yīng)溫度

由圖1可知，溫度對固定化酶有較大的影響，固定化酶的最適溫度為50℃，在40～70℃的范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好，酶活力保持在70%以上，具有良好的穩(wěn)定性。

2.2 固定化酶的最適pH

在不同pH條件下測得游離酶和固定化酶的活力變化如圖2。

圖2 固定化酶的最適反應(yīng)pH

由圖2可知，pH低于5時，強(qiáng)酸性環(huán)境容易破壞磁性殼聚糖微球的穩(wěn)定性，固定化酶的最適pH在7左右，pH6～9范圍內(nèi)酶活力保持在80%以上，與游離酶相比耐堿性增強(qiáng)。

2.3 固定化酶的熱穩(wěn)定性

在不同溫度下，將游離酶和固定化酶保持1h，然后測其酶活力，如圖3。

由圖3可知，固定化酶較游離酶的熱穩(wěn)定性提高，70℃以下保溫1h，酶活力保持80%以上，可知固定化酶的耐熱性增強(qiáng)。

2.4 固定化酶的儲存穩(wěn)定性

將固定化酶4℃儲存 1、5、15、20、25、30d，測其酶活力變化，見圖4。

圖3 固定化酶的熱穩(wěn)定性

圖4 固定化酶的貯存性

由圖4可知，固定化酶在4℃下保存15d時，保持85%的酶活力，20d還具有70%的酶活力，說明固定化酶具有良好的儲存性。

2.5 固定化酶的操作穩(wěn)定性

將固定化酶連續(xù)操作使用10次，測其酶活力的變化，如圖5。

圖5 酶蛋白與載體結(jié)合的牢固程度

由圖5可以看出，5次操作后保持80%的酶活，連續(xù)操作10次保持50%的酶活力。磁性殼聚糖微球固定化酶制備工藝比較繁瑣，成本較高，其操作穩(wěn)定性有待進(jìn)一步研究，需提高其使用次數(shù)，降低固定化成本。

3 結(jié)論

通過對磁性殼聚糖微球固定化β－呋喃果糖苷酶性質(zhì)研究，結(jié)果表明:固定化β－呋喃果糖苷酶與游離酶相比，最適pH向堿性一側(cè)偏移約為2.5，表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐堿性;最適溫度為50℃，耐高溫能力增強(qiáng)，在小于70℃范圍內(nèi)有良好的熱穩(wěn)定性;在pH6～9的范圍具有良好的pH穩(wěn)定性;固定化酶在4℃下保存15d后，剩余酶活力為80%左右，具有良好的儲存穩(wěn)定性;連續(xù)10次操作后保持50%的酶活，具有良好的操作性，固定化酶回收率為26%。

［1］張寧，曹勁松，彭志英.液－液雙相體系中β－D－呋哺果糖苷酶催化轉(zhuǎn)移反應(yīng)的特性［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2001，27(9):16－20.

［2］Quang D，Nguyen，Judit M，et al.Purification and some properties of β － fructofuranosidase from Aspergillus niger［J］.Process Biochemistry，2005，40(7):2461－2466.

［3］N Duran，MA Rosa，A D’Annibale，et al.Applications of laccasesand tyrosinases(phenoloxidases)immobilized on different supports:a review［J］.Enzym Microb Technol，2002，31:907－931.

［4］RS Juang，F(xiàn)C Wu，RL Tseng.Use of chemically modified chitosan beads for sorption and enzyme immobilization［J］.Adv Environ Res，2002(6):171－177.

［5］姜德生，龍勝亞，肖海燕，等.磁性殼聚糖微球的制備及其作用漆酶固定化載體［J］.應(yīng)用化學(xué)，2005，22(10):1122－1126.

Study on β－fructofuranosidase immobilized with magnetic chitosan microspheres

XU Mu－dan，ZENG Ling－jun，YAO Jia－yu，LIU Hong－mei
(College of Life Science and Technology，Shaanxi University of Science and Technology，Xi’an 710021，China)

TS201.2+5

A

1002－0306(2010)08－0180－03

2009－07－31

許牡丹(1963－)，女，教授，碩士，研究方向:食品生物技術(shù)及分析檢測。