動(dòng)物蛋白酶酶解制備廣西產(chǎn)牡蠣肉抗腫瘤活性肽的實(shí)驗(yàn)研究

陳艷輝，李超柱，黎丹戎，蔣 維，孫聞續(xù)，李家明，方懷儀

(1.廣西欽州學(xué)院，廣西欽州535000;2.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西南寧530021)

動(dòng)物蛋白酶酶解制備廣西產(chǎn)牡蠣肉抗腫瘤活性肽的實(shí)驗(yàn)研究

陳艷輝1，李超柱1，黎丹戎2，*，蔣 維2，孫聞續(xù)2，李家明1，方懷儀1

(1.廣西欽州學(xué)院，廣西欽州535000;2.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西南寧530021)

目的:采用動(dòng)物蛋白酶作為工具酶對(duì)牡蠣蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解，并對(duì)酶解條件采用正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。以期獲得具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的活性肽。方法:利用正交實(shí)驗(yàn)L9(33)，以氨基氮生成率和腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為觀察指標(biāo)，確定動(dòng)物蛋白水解酶水解廣西產(chǎn)牡蠣肉的水解條件如溫度、酶量、水解時(shí)間，并對(duì)最佳水解產(chǎn)物進(jìn)行柱層析和超濾分離獲得不同分子量的多肽，采用MTT法檢測(cè)了各組分對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNE－1生長(zhǎng)的抑制作用。結(jié)果:動(dòng)物蛋白水解酶在60℃、酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0‰、水解時(shí)間為4h的水解條件下獲得的水解氨基氮含量最高;水解產(chǎn)物在分子量為小于3000Da多肽具有明顯地抑制鼻咽癌CNE－1細(xì)胞的生長(zhǎng)作用。結(jié)論:選取動(dòng)物蛋白水解酶作用的最佳條件，可以獲得具有抗腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的牡蠣蛋白活性肽，具有進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用的價(jià)值。

牡蠣，活性肽，抗腫瘤

Abstract:Objective:Using animal protein proteasome as a tool enzyme to enzymatic hydrolyze with oyster protein，the bioactive peptide that can inhibit the growth of tumour cells was obtained，and condition of enzymatic hydrolysis was optimized by orthogonal experiment.Methods:according to observed indicators of amino nitrogen production rate and tumor cell growth inhibition，definite technological parameters of the hydrolysis conditions such as temperature，enzyme amount and time on hydrolyzing Guangxi oyster by animal protein zymohydrolysis were determined by orthogonaltestL9(33).Polypeptideofdifferentmolecularweightbymeansofcolumn chromatography，ultrafiltration of the best hydrolysate was gotten.The inhibited effects of all the constituents on the growth of nasopharyngeal carcinoma cells CNE－1 were tested by MTT.Results:The highest content of hydrolysis amino nitrogen was obtained on the condition that the temperature of animal protein zymohydrolysis of 60℃，that mass fraction of the enzyme of 2.0‰，and that hydrolyzing time of 4h.The polypeptide that with less than 3000Da molecular weight has evident inhibited effects on the growth of nasopharyngeal carcinoma cells CNE－1.Conclusion:We can get oyster protein bioactive peptide that can inhibit the growth of tumour cells on the best condition of animal protein zymohydrolysis.The research is worth a further development and application.

Key words:oyster;bioactive peptide;antitumor

蛋白質(zhì)是一類最重要的生物大分子，是生物功能的主要載體。天然蛋白質(zhì)不完全水解產(chǎn)生的長(zhǎng)短不一的一些肽段具有其前體所沒有的特殊生理功能，這些有特殊的生理活性的肽類稱為生物活性肽，而非活性肽在體內(nèi)僅起氨基酸營(yíng)養(yǎng)源的作用。海洋天然活性物質(zhì)抗腫瘤研究是抗腫瘤藥物研發(fā)的一個(gè)重要領(lǐng)域［1］，但有關(guān)海洋生物活性肽抗腫瘤作用研究則仍未得到足夠重視。這是因?yàn)樘烊淮嬖诘暮Ｑ蠡钚噪脑谏矬w中含量低，而且提取困難，難以實(shí)現(xiàn)大量生產(chǎn)，化學(xué)合成的活性肽成本昂貴［2］。因此有必要以來源豐富的海洋動(dòng)物蛋白為原料，水解分離具有特殊活性的小分子肽段，實(shí)現(xiàn)規(guī)?；笊a(chǎn)小分子多肽。牡蠣也稱大蠔，是廣西欽州海洋水產(chǎn)品中產(chǎn)量最高的經(jīng)濟(jì)貝類。大量的文獻(xiàn)報(bào)道稱，牡蠣提取物或蛋白水解物中存在著免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤的生物學(xué)效應(yīng)、抗氧化、抗衰老、降血糖作用及抗病毒抗菌等功能物質(zhì)［3－4］。為了進(jìn)一步開發(fā)牡蠣的藥用資源，尋找結(jié)構(gòu)特異、活性獨(dú)特的抗腫瘤活性多肽，本課題利用動(dòng)物蛋白酶為工具酶，探討酶水解牡蠣蛋白的最佳條件，并測(cè)定了各水解產(chǎn)物的抗腫瘤活性。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

牡蠣 購自廣西欽州水產(chǎn)品市場(chǎng)，經(jīng)廣西水產(chǎn)研究所李詠梅研究員鑒定為近江牡蠣(Crassostrea rivularis);乙腈、甲醇 色譜純，Merck公司;動(dòng)物蛋白水解酶 ≥200U·mg－1，廣西南寧龐博生物工程有限公司。

多功能食品粉碎機(jī) 上海海菱公司;高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;紫外檢測(cè)儀 日本島津儀器有限公司;數(shù)字酸度計(jì) 上海大普儀器有限公司;微型等電聚焦電泳儀 美國(guó)BIO－RAD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牡蠣肉的酶解工藝的確定 取牡蠣肉，清洗，勻漿，選擇動(dòng)物蛋白酶，酶解工藝條件的設(shè)計(jì)見表1，分別在各反應(yīng)條件下進(jìn)行牡蠣肉蛋白質(zhì)的水解實(shí)驗(yàn)。酶解結(jié)束后，95℃滅酶，分別測(cè)定每一反應(yīng)條件下氨基氮生成率。

表1 動(dòng)物蛋白酶水解牡蠣肉蛋白質(zhì)的正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.2.2 氨基氮生成率的測(cè)定 采用甲醛滴定法測(cè)定氨基氮總量，凱氏定氮法測(cè)定總氮。氨基氮生成率按照下式計(jì)算:

氨基氮生成率(%)=(游離氨基氮總量/總氮)×100%

1.2.3 牡蠣酶解液中活性肽的分離制備工藝路線原料蛋白→預(yù)處理→選擇最佳酶解條件水解→高溫滅酶→活性炭脫苦味去色→柱層析、超濾膜分離→冷凍干燥→組成與結(jié)構(gòu)鑒定

1.2.4 牡蠣肽對(duì)鼻咽癌CNE－1細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用取指數(shù)生長(zhǎng)期CNE－1細(xì)胞用0.5%胰蛋白酶消化，加入含小牛血清的培養(yǎng)液計(jì)數(shù)并稀釋至1×105個(gè)/mL。將稀釋的細(xì)胞懸液按100μL/孔接種至96孔板，置于37℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育24h至細(xì)胞貼壁后，加入不同分子量大小及不同濃度的牡蠣活性肽，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h，加入20μL的5mg/mL的MTT，于37℃、5%的CO2條件下孵育4h，棄盡孔內(nèi)液，每孔中加入100μL的DMSO溶解MTT產(chǎn)物。用酶標(biāo)儀振蕩30s后于490nm處測(cè)定每個(gè)孔的OD值。實(shí)驗(yàn)中另設(shè)只加細(xì)胞而不加任何藥物的空白對(duì)照組，以PBS補(bǔ)足體積。按下列公式計(jì)算抑制率:

生長(zhǎng)抑制率(%)=(1－用藥平均A值/對(duì)照平均A值)×100%

當(dāng)生長(zhǎng)抑制率為50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的活性肽濃度稱為半數(shù)抑制濃度IC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶水解條件的選擇與確定

采用正交設(shè)計(jì)研究了溫度、加酶量和反應(yīng)時(shí)間3個(gè)單因素對(duì)酶解液水解率的影響，優(yōu)化動(dòng)物蛋白酶的酶解工藝參數(shù)，確定最佳酶解條件。由表2可見:影響動(dòng)物蛋白酶酶解液氨基氮生成率和抗腫瘤活性的主要因素依次為溫度＞時(shí)間＞酶用量，其中酶解溫度對(duì)動(dòng)物酶解液的抗腫瘤活性影響最大，在酶解時(shí)間相同的條件下，隨著酶解溫度的增加，牡蠣蛋白的水解度增大，溫度為60℃時(shí)，動(dòng)物蛋白酶對(duì)牡蠣蛋白的水解度最大。溫度對(duì)反應(yīng)速率的影響主要是影響反應(yīng)速率常數(shù)，在較低的溫度范圍內(nèi)，反應(yīng)速率常數(shù)隨著溫度的增加而增加，因而酶反應(yīng)速率增加。加入酶的量越多，水解程度越高，在溫度60℃時(shí)，2‰的酶量，4h后蛋白已水解徹底。且水解程度越高，對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用越強(qiáng)，IC50值越小，結(jié)果見表2。

表2 蛋白酶水解正交實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 牡蠣肽不同水解分子對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

本研究所采用的動(dòng)物酶主要含有胰蛋白酶和Flavourzyme，該復(fù)合酶共同作用的水解產(chǎn)物的多肽分子量分布是連續(xù)的，其范圍主要分布在2000～50000Da之間，而60%的水解產(chǎn)物主要集中在小于1000～3000Da間。從表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，牡蠣蛋白經(jīng)酶解反應(yīng)后其產(chǎn)物抗癌活性有較大的差異，說明酶解反應(yīng)過程的生成眾多的短肽和游離的氨基酸，其中可能含有長(zhǎng)度不同的多肽具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。因此，本研究將對(duì)鼻咽癌細(xì)胞抑制作用最強(qiáng)的水解產(chǎn)物進(jìn)一步分離、超濾后獲得不同分子量大小的多肽，不同濃度的牡蠣多肽作用于鼻咽癌CNE－1細(xì)胞后，采用MTT法測(cè)定其對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。從表3可以看出，分子量為3000Da的牡蠣多肽對(duì)鼻咽癌CNE－1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率出現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，即濃度越高，抑制率越強(qiáng)。能夠抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的活性肽主要存在于分子量小于14000Da的肽段中。

表3 不同濃度的牡蠣多肽對(duì)鼻咽癌CNE－1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率(n=3)(%)

3 討論

由于利用蛋白酶解制備小分子多肽可實(shí)現(xiàn)規(guī)?；笊a(chǎn)，目前，活性肽的主要生產(chǎn)方法通過酶法制備，而酶的選擇是生產(chǎn)活性肽的關(guān)鍵，酶的水解能力具有專一性，若想獲得具有獨(dú)特活性的多肽，單用一種酶有時(shí)效果不佳［6］，因此本研究采用動(dòng)物蛋白水解復(fù)合酶系，該酶是由蛋白內(nèi)切酶、外切酶和風(fēng)味酶組成。評(píng)價(jià)水解產(chǎn)物優(yōu)劣，過去一般以水解度(DH)和肽的得率為指標(biāo)，本研究還結(jié)合活性肽對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用強(qiáng)弱為指標(biāo)，綜合評(píng)判牡蠣活性肽的水解效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水解氨基氮含量高的組分，活性肽分子量小于3000Da的水解產(chǎn)物，其抑制鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)的能力較強(qiáng)。

在研究動(dòng)物蛋白水解酶水解牡蠣蛋白的最佳水解條件時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)最適溫度不是酶的特征常數(shù)，只有在固定時(shí)間條件下才有意義。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酶的活力逐漸衰減，比如酶解3h的最適溫度必然不同于酶解4h的最適溫度，這一點(diǎn)常為國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)所忽視。酶量過高時(shí)，由于酶本身的相互水解作用加強(qiáng)，會(huì)阻礙酶對(duì)底物的水解，并非酶量越多越好。在最佳反應(yīng)條件下，隨時(shí)間的推移，水解程度加大，水解產(chǎn)物的分子量減小，水解液的肽段分子量分布會(huì)不斷地發(fā)生變化。因此進(jìn)行大規(guī)模水解牡蠣蛋白前必須進(jìn)行水解條件的優(yōu)化組合。

超濾原理近似機(jī)械篩分，是利用膜的選擇性，以膜兩側(cè)存在的一定量能量差作為推動(dòng)力，通過溶液中各組分透過膜的遷移速率的不同而實(shí)現(xiàn)非均相物系的分離。由于超濾膜具有不對(duì)稱微孔結(jié)構(gòu)，且采用薄層流道和湍流促進(jìn)結(jié)構(gòu)，減少膜的污染，在分離過程中，使得大分子溶質(zhì)和微粒(如膠體或淀粉等)隨溶液切向流經(jīng)膜表面，而小分子物質(zhì)和溶劑則在壓力驅(qū)動(dòng)下穿過致密層上的微孔而進(jìn)入膜的另一側(cè)，因而超濾膜可以長(zhǎng)期連續(xù)使用并保持較恒定的產(chǎn)量和分離效果。與傳統(tǒng)工藝相比較，超濾不僅可以提高產(chǎn)品的純度、節(jié)約溶劑或試劑的耗用量，而且能夠?qū)崿F(xiàn)連續(xù)化分離純化，縮短生產(chǎn)周期。正是利用這一節(jié)能減排的技術(shù)，本研究獲得了具有較強(qiáng)抗腫瘤活性，分子量小于3000Da的多肽。因此有必要進(jìn)一步對(duì)分子量低于14000Da的多肽進(jìn)行系統(tǒng)的分離純化，以其獲得更多的活性分子。

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Experimental research on animal proteasome enzymatic hydrolysis for preparing antitumor bioactive peptide from oyster of Guangxi province

CHEN Yan－h(huán)ui1，LI Chao－zhu1，LI Dan－rong2，*，JIANG Wei2，SUN Wen－xu2，LI Jia－ming1，F(xiàn)ANG Huai－yi1
(1.Qinzhou College of Guangxi，Qinzhou 535000，China;2.Guangxi Medical University，Nanning 530021，China)

TS201.2

A

1002－0306(2010)08－0167－03

2009－12－30 *通訊聯(lián)系人

陳艷輝(1958－)，女，副教授，研究方向:天然產(chǎn)物化學(xué)和有機(jī)合成化學(xué)。

廣西自然基金(桂科自0832281);廣西教育廳面上項(xiàng)目(200708MS072、200911MS241)。