響應(yīng)面法優(yōu)化桃金娘色素的提取工藝

張少敏，陳文芬，趙謀明

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640)

響應(yīng)面法優(yōu)化桃金娘色素的提取工藝

張少敏，陳文芬，趙謀明*

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640)

為得到桃金娘果實色素的最佳提取工藝條件，采用全波長掃描得出桃金娘色素的最大吸收波長和最佳提取劑及其最佳pH，在此基礎(chǔ)上，以提取時間(A)、提取劑體積分?jǐn)?shù)(B)、液料比例(C)、提取溫度(D)為單因素考察因子，以最大吸收波長處的吸光值為響應(yīng)值，運用響應(yīng)面對其提取工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，pH為1.0的酸化乙醇為桃金娘色素的最佳提取溶劑，且最大吸收峰λmax為520nm，響應(yīng)面分析得到四個因素的最佳組合為:提取時間3.56h，乙醇濃度54.55%，液料比22.36mL/g，溫度64.78℃，在該條件下色素理論最大提取值為0.6070，實際驗證值為0.6177，兩者誤差較小，表明該條件組合較好。

桃金娘，色素，響應(yīng)面，吸光值

Abstract:In order to get the optimal extraction conditions of Rhodomyrtus tomentosa pigment，full wavelength scanning was used to obtain the maximum absorption wavelength and the optimal pH of the extraction agent.The effects of extraction time，volume fraction of alcohol，material-solvent ratio and extraction temperature on absorbance were studied.Based on the single factor test，the absorbance at the maximum absorption peak as index，response surface method was used to optimize its technique parameters.The optimal condition showed as follows:the optimal extractant was acidified ethanol with pH1.0，the maximum absorption wavelength was 520nm.The optimized extraction parameters were extraction time 3.56h，54.55%(volume fraction)alcohol condition，material-solvent ratio 1∶22.36 and extraction temperature 64.78℃.Under the optimal conditions，the absorbance at the maximum absorption wavelength of pigment extract was 0.6070，the actual verification value was 0.6177 which had less errors compared with the predicted value.

Key words:Rhodomyrtus tomentosa;pigment;response surface methodology;absorbance

大多天然色素色澤純正，安全性高，有些對人體還有一定的保健作用［1］，天然色素的研究與開發(fā)已成為國內(nèi)外食品領(lǐng)域研究的熱點。國外的食品著色劑正逐步向以天然色素為主，合成色素為輔的方向發(fā)展。我國的天然食用色素研究起步相對較晚，目前尚處于天然色素與合成色素并存的狀況，但我國已把開發(fā)天然食用色素作為發(fā)展食品添加劑的一個重要方向［2］。桃金娘為桃金娘科藥用植物，又稱稔子、山稔，主要分布于我國南方各省，桃金娘的果實完全成熟時味甜，略有澀味，汁液呈誘人的紫紅色，富含多糖、蛋白質(zhì)、單寧、黃酮類、花青素、萜類化合物、氨基酸、微量元素和維生素等多類化學(xué)成分［3-4］，且有研究表明其對化膿鏈球菌具有抑制作用［5］，是一種難得的藥膳同源新資源，具有較高的開發(fā)利用價值。目前對于桃金娘的開發(fā)利用主要集中在醫(yī)藥、植物資源、生態(tài)學(xué)［6］等領(lǐng)域，食品領(lǐng)域中對桃金娘果實在飲料［7-8］方面的研究較多，對其果實中的色素研究很少，而桃金娘色素具有色澤鮮亮，無毒，無異味等優(yōu)點，并兼有多種營養(yǎng)成分，符合現(xiàn)代人對健康、安全理念的要求，具有廣闊的開發(fā)前景。本研究在確定桃金娘色素最大吸收波長的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化了桃金娘色素的提取工藝，為對其深入研究和開發(fā)應(yīng)用提供了指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

全熟的桃金娘果實 采于廣東茂名，干燥粉碎后經(jīng)80目過篩，裝于封口袋密封待用;無水乙醇、乙酸乙酯、甲醇、石油醚、濃鹽酸等 均為分析純。

SHZ-82A恒溫振蕩器 常州澳華儀器有限公司;GL-21M高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司;pHS-25數(shù)顯pH計 上海精密儀器有限公司;UV-1800紫外-可見分光光度計 日本島津公司;UV-2100紫外可見分光光度計 尤尼科(上海)儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 色素測定方法 我國食品添加劑標(biāo)準(zhǔn)化委員會建議采用比吸光度表示色素含量［9］。

式中:A為樣品稀釋至100mL時，用1cm比色皿測得最大吸收波長下的吸光度;m為樣品質(zhì)量，g。

由上式可以看出，當(dāng)樣品質(zhì)量相同時，色素的比吸光度與吸光度成正比，在本實驗中，樣品質(zhì)量相同，所以為了方便起見直接用吸光度值(A)分析比較不同提取條件下色素的提取效果。

1.2.2 桃金娘色素的提取工藝 桃金娘果實干品→粉碎→過篩(80目)→提取→離心(8000r/min)→抽濾→定容→測定吸光值

1.2.3 提取劑的選擇及最大波長的確定 準(zhǔn)確稱取3.00g桃金娘粉末于錐形瓶內(nèi)，以10∶1的液料比分別加入30mL的蒸餾水、0.5%鹽酸-蒸餾水、0.5%鹽酸-75%乙醇、75%乙醇、0.5%鹽酸-75%甲醇、75%甲醇、乙酸乙酯、石油醚。在55℃下振蕩提取2.0h，8000r/min離心 15min，抽濾，全部濾液定容至100mL，觀察色澤差異，初步確定該色素的最佳提取溶劑，并用UV-1800紫外可見分光光度計在400～700nm的波段內(nèi)掃描各提取液的最大吸收波長(λmax)，最終確定該色素的最佳提取溶劑。

1.2.4 提取劑最佳pH的確定 用鹽酸將提取溶劑的 pH 分別調(diào)為 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，其他操作同

1.2.3 ，在400～700nm波長范圍內(nèi)掃描確定提取溶劑的最佳提取pH，并對1.2.3得到的最大波長進(jìn)行驗證。

1.2.5 響應(yīng)面設(shè)計 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，取樣品1.00g進(jìn)行響應(yīng)面實驗并將提取液定容至50mL，以提取時間(A)、乙醇濃度(B)、液料比(C)、提取溫度(D)為自變量，最大吸收波長處吸光值為響應(yīng)值，設(shè)計四因素五水平的二次回歸方程擬合自變量和色素吸光值之間的函數(shù)關(guān)系，采用響應(yīng)面分析方法優(yōu)化提取工藝。實驗設(shè)計因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計因素水平表

表2 桃金娘色素在不同提取劑中的溶解性和色澤變化

2 結(jié)果與討論

2.1 提取劑的選擇及最大波長的確定

由表2和圖1可見，乙醇和甲醇的酸性溶液更適合于作為桃金娘色素的提取溶劑，這兩種提取劑得到的色素提取液具有明顯的吸收峰，且均在520nm。從安全性角度考慮，選取酸性乙醇為最佳提取劑，最大吸收波長為520nm。

圖1 不同提取劑中的桃金娘色素掃描吸收光譜

2.2 提取劑pH對提取效果的影響

由圖2可知，由pH1.0的提取液在520nm處具有明顯的吸收峰，且呈紫紅色，其他pH下的吸收峰均不明顯，顏色較淡，可知極酸性條件對于桃金娘色素具有明顯的護(hù)色效應(yīng)，為了穩(wěn)定后續(xù)單因素的實驗條件將提取劑pH定為1.0。

圖2 不同pH的75%乙醇提取劑中色素掃描吸收光譜

2.3 單因素實驗結(jié)果

由于提取時間影響色素活性物質(zhì)與提取劑的充分接觸，提取劑濃度影響溶劑極性，進(jìn)而影響色素的溶解情況，液料比影響色素是否能最大程度的溶解出來和提取成本的節(jié)約，溫度影響色素的穩(wěn)定性與提取率，因此選取這4個因素進(jìn)行實驗，單因素結(jié)果表明:提取時間為4h、乙醇濃度為50%、液料比為20mL/g、提取溫度為65℃時色素吸光值最大，提取效果最好。因此選取時間3～5h，乙醇濃度40%～60%，液料比12～28mL/g，提取溫度55～75℃為響應(yīng)面實驗范圍。

2.4 響應(yīng)面實驗結(jié)果

2.4.1 響應(yīng)面實驗設(shè)計結(jié)果與方差分析 本實驗利用Design-Expert軟件中的中心組合設(shè)計(CCD)選項，獲得桃金娘色素提取的四因素五水平實驗設(shè)計及結(jié)果，見表3。

表3 響應(yīng)面分析實驗設(shè)計與結(jié)果

根據(jù)表3實驗結(jié)果，經(jīng)回歸擬合后，各實驗因子對響應(yīng)值的影響可通過以下回歸方程表示:

色素提取液吸光值=0.58-0.011A+0.027B+0.032C+5.063×10-3D-7.444×10-3AB-4.344×10-3AC-0.016AD-2.069×10-3BC+0.023BD-0.045CD-0.020A2-0.010B2-0.017C2-0.031D2

由方差分析結(jié)果(表4)可知:F回歸模型=69.47＞F0.01，p＜0.0001，方程達(dá)到極顯著水平，同時 F失擬=3.01＜F0.01，P ＞0.05，模型 R2adj為 0.9706，表明該方程對實驗擬合程度較好，實驗誤差小，可用該方程對不同提取條件下的色素提取效果進(jìn)行預(yù)測。

通過回歸方程系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果表5可知，因素A、B、C對色素提取效果影響極顯著(p＜0.01)，因素D對色素提取效果影響顯著(p＜0.05);四個實驗因素的二次項對色素提取效果影響均為極顯著(p＜0.01)，交互項中 AB對提取效果影響顯著(p＜0.05)，AD、BD、CD交互項對提取效果影響極顯著(p＜0.01)，表明各影響因素與響應(yīng)值不是簡單的線性關(guān)系。對回歸方程中一次項系數(shù)的絕對值進(jìn)行比較，可判斷因子影響的主次性［10］，結(jié)合方差分析得到各實驗因子對色素提取液吸光度的影響主次順序為:液料比＞乙醇濃度＞提取時間＞提取溫度。

依據(jù)方差分析結(jié)果，剔除不顯著項，簡化后的回歸方程為:

色素吸光值=0.58-0.011A+0.027B+0.032C+5.063×10-3D-7.444×10-3AB-0.016AD+0.023BD-0.045CD-0.020A2-0.010B2-0.017C2-0.031D2

2.4.2 各因素間的交互作用分析 如果一個響應(yīng)曲面坡度相對平緩，表明其可以忍受處理條件的變異，而不影響到響應(yīng)值的大小，相反，如果一個響應(yīng)曲面坡度非常陡峭，表明響應(yīng)值對于處理條件的改變非常敏感［11］。本實驗響應(yīng)值對交互項中 AB、AD、BD、CD交互作用較為敏感，即這四個交互項方差分析結(jié)果顯示顯著或極顯著。

由圖3可知，提取時間和乙醇濃度的交互作用對色素提取效果影響顯著(p=0.0198)，時間小于4h時，隨著時間增大色素提取量逐漸增大，當(dāng)時間大于4h以后，隨著時間增大色素提取量逐漸下降;在低乙醇濃度(40%～55%)條件下，隨提取劑濃度的增大，色素提取量逐漸增大，當(dāng)濃度超過55%之后，隨提取劑濃度增大，色素提取效果趨于平緩，并有下降趨勢。

圖3 提取時間和乙醇濃度的交互作用對色素提取效果的影響

由圖4可知，提取時間和提取溫度的交互作用對色素提取效果影響極顯著(p＜0.0001)，在4.5h之內(nèi)隨時間增大色素提取量逐漸增大，當(dāng)時間超過4.5h后隨時間增大色素提取量明顯降低;在低溫條件下(55～65℃)，隨著溫度的增加色素提取量明顯增大，當(dāng)溫度超過65℃后，隨著溫度的增加色素提取效果明顯下降。

圖4 提取時間和提取溫度的交互作用對色素提取效果的影響

由圖5可知，乙醇濃度和提取溫度的交互作用對色素提取效果影響極顯著(p＜0.0001)，在低溫條件下(55～65℃)，隨著乙醇濃度的增大，色素提取效果緩慢增加，當(dāng)乙醇濃度超過55%之后，隨著濃度的增大，色素提取效果呈明顯降低趨勢，在較高溫度下(65～75℃)，隨著乙醇濃度逐漸增大，色素提取效果始終呈現(xiàn)增加趨勢。乙醇濃度在40%～60%范圍內(nèi)變化時，隨著溫度的增大，以65℃為轉(zhuǎn)折點，色素提取量先增大后下降。

表4 色素提取回歸模型方差分析表

表5 色素提取回歸方程系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果

圖5 乙醇濃度和提取溫度的交互作用對色素提取效果的影響

由圖6可知，液料比例和提取溫度的交互作用對色素提取效果影響極顯著(p＜0.0001)，在低溫條件下(50～60℃)，隨著液料比例的增大，色素提取效果始終呈增大趨勢，在較高溫度下(60～75℃)，隨著液料比例的增大，色素提取效果明顯下降;在小液料比(12～16mL/g)條件下，隨著溫度的增大，色素提取效果逐漸增大。在較大液料比(16～28mL/g)條件下，隨著溫度的增大色素提取效果明顯下降。

圖6 液料比和提取溫度的交互作用對色素提取效果的影響

2.5 最佳提取條件選擇與驗證

運用Design-Expert處理得到四個因素的最佳組合為:提取時間3.56h，乙醇濃度54.55%，液料比22.36，溫度64.78℃，在該條件下色素理論最大提取值為0.6070。為了考察該最佳條件組合的可靠性，在該條件下對色素最大提取量進(jìn)行驗證，考慮到實際可操作性，提取時間定為3.6h，乙醇濃度定為55%，液料比定為22mL/g，溫度定為65℃對其進(jìn)行驗證，重復(fù)4次實驗，得到的實際色素吸光值為0.6177，與理論預(yù)測值較為接近，誤差為0.0176，表明該數(shù)學(xué)模型對優(yōu)化桃金娘色素提取工藝的可行性較好。

3 結(jié)論

本實驗采用全波長掃描得到桃金娘色素的最大吸收波長λmax為520nm，并確定pH為1.0的酸性乙醇為最佳提取試劑，采用響應(yīng)面法得到桃金娘色素最佳提取工藝為:提取時間3.56h，乙醇濃度54.55%，液料比22.36mL/g，溫度64.78℃。在此條件下的驗證值為 0.6177，與理論預(yù)測值 0.6070較接近，誤差為0.0176。

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Optimization of extraction technique of pigment from Rhodomyrtus tomentosa by response surface methodology

ZHANG Shao-min，CHEN Wen-fen，ZHAO Mou-ming*
(College of Light Industry and Food，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China)

TS202.3

B

1002-0306(2010)08-0190-05

2009-12-24 *通訊聯(lián)系人

張少敏(1987-)，女，碩士研究生，研究方向:食品生物技術(shù)。

國家863計劃重點項目(2007AA100404);廣東省科技計劃項目(2008A010900003)。