巨大口蘑和草菇貯藏期間褐變及相關(guān)酶活性研究

楊春敏，莫美華

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州510642)

巨大口蘑和草菇貯藏期間褐變及相關(guān)酶活性研究

楊春敏，莫美華*

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州510642)

把巨大口蘑和草菇貯藏在15℃、濕度為90%左右的條件下，分別對(duì)它們褐變相關(guān)的多酚氧化酶、酪氨酸酶和漆酶活性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示:巨大口蘑多酚氧化酶活性整體呈下降趨勢(shì)，新鮮和貯藏4d后的酶活性分別為138.89、97.78U·mL-1·min-1·FW。草菇多酚氧化酶活性變化呈上升趨勢(shì)，新鮮和貯藏4d后的多酚氧化酶活性分別為185.56、608.89U·mL-1·min-1·FW;巨大口蘑酪氨酸酶活性略高于草菇，兩者均呈下降趨勢(shì);巨大口蘑漆酶活性變化呈先升高后下降趨勢(shì)，貯藏3d后達(dá)到峰值1.35U·mL-1·min-1·FW。而草菇漆酶活性均低于0.1U·mL-1·min-1·FW，且呈下降趨勢(shì)。巨大口蘑褐變速度比草菇慢，貯藏7d后，巨大口蘑和草菇褐變度分別為5.38%、29.86%。

多酚氧化酶，酪氨酸酶，漆酶，褐變度

Abstract:Tricho/oma giganteum and Vo/varie//a vo/vacen were stored in 15℃and humidity of 95%.The changes in browing and the activities of polyphenol oxidase(PPO)，Tyrosinase(TYE)and Lacease of Tricho/oma giganteum and Vo/varie//a vo/vacen were investigated.The results showed that:The activity of PPO of Tricho/oma giganteum was downtrend during storage，and the activity of PPO of fresh and 4d after storage of Tricho/oma giganteum were 138.89 and 97.78U·mL-1·min-1·FW，respectively.The activity of PPO of Vo/varie//a vo/vacen rose during storage，and the activity of PPO of fresh and 4d after storage of Vo/varie//a vo/vacen were 185.56 and 608.89U·mL-1·min-1·FW，respectively.The activity of TYE of Tricho/oma giganteum slightly higher than that of Vo/varie//a vo/vacen，and both the activities of TYE were downtrend.The activity of laccase of Tricho/oma giganteum rose initially and then dropped，with the highest activity of laccase reached 1.35U·mL-1·min-1·FW on 3d after storage.The activity of laccase of Vo/varie//a vo/vacen was downtrend and lower than 0.1U·mL-1·min-1·FW during storage.The browning speed of Tricho/oma giganteum was slower than that of Vo/varie//a vo/vacen during storage.7d after storage，the browning degree of Tricho/oma giganteum and Vo/varie//a vo/vacen were 5.38%and 29.86%，respectively.

Key words:polyphenol oxidase;tyrosinase;laccase;browning degree

食用菌在貯運(yùn)加工過程中常發(fā)生組織褐變，風(fēng)味變劣，嚴(yán)重影響外觀品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，導(dǎo)致商品價(jià)值低下，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重［1］。褐變一般可分為兩大類:一類是在氧化酶催化下的多酚類物質(zhì)的氧化變色，稱為酶促褐變;另一類是沒有酶參與的非酶褐變。而食用菌的褐變，主要是多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO)引起的酶促褐變［2］。酶學(xué)界根據(jù) PPO催化的底物不同和底物中酚羥基的位置和數(shù)目將多酚氧化酶分為三大類:單酚氧化酶［酪氨酸酶(tyrosinase，TYE)］、雙酚氧化酶［兒茶酚氧化酶(catechol oxidase)或鄰苯二酚氧化酶(o-diphenol oxadise)，對(duì)苯二酚氧化酶(p-diphenol oxadise)］和漆酶(lacease)［3-4］。有報(bào)道指出，酪氨酸酶是導(dǎo)致雙孢蘑菇褐變的關(guān)鍵酶［5］;草菇褐變主要由多酚氧化酶和蛋白酶作用導(dǎo)致［6-7］。通過前期研究發(fā)現(xiàn):巨大口蘑子實(shí)體可在8～12℃條件下保存30d而不變色、不腐爛、不生蟲，耐貯運(yùn)性很好［8］。為了探明巨大口蘑抗褐變的機(jī)理，測(cè)定了在貯藏期間巨大口蘑和草菇的褐變度及其與之相關(guān)的酶活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

巨大口蘑 廣東省連南食用菌研究所(陳秋來提供);草菇 廣州市花都雙崗草菇場(chǎng);磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 廣州化學(xué)試劑廠，分析純;鄰苯二酚國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，化學(xué)純;鄰聯(lián)甲苯胺上海晶體試劑有限公司，分析純;冰醋酸 天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純。

MP402B電子天平 中國(guó)上海精科天平廠;LRH-250-Ⅱ生化培養(yǎng)箱 中國(guó)廣東省醫(yī)療器械廠;GL21低溫冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;XMT-DA電熱恒溫干燥箱 中國(guó)廣州市康恒儀器有限公司;UV-7500紫外可見分光光度計(jì) 中國(guó)上海精密科學(xué)儀器有限公司;DK-8D電熱恒溫水浴鍋中國(guó)上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;DC-P3全自動(dòng)色差計(jì) 中國(guó)北京市興光測(cè)色儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 貯藏方法 挑選新鮮無病蟲的蘑菇子實(shí)體，分裝于塑料保鮮袋中，在15℃生化培養(yǎng)箱中貯藏。定期取樣測(cè)定兩種菇的酶活性和褐變度，設(shè)3個(gè)重復(fù)。所得數(shù)據(jù)采用Excel和SAS V9.0版軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.2 多酚氧化酶活性測(cè)定方法 參照Zauberman等［9-10］，取 4.00g 菇子實(shí)體，洗凈，放入研缽中，按 1∶5(W/V)加入0.05mol磷酸緩沖液(pH6.8，含2.5%PVP)，冰浴研磨，于4℃、8500r/min 離心15min，上清液作為酶提取液。PPO測(cè)定體系為2.5mL，其中0.05mol磷酸緩沖液(pH6.8)1.95mL與0.1mol鄰苯二酚0.5mL混合后預(yù)熱至25℃，然后迅速加入PPO提取液50μL，混勻，記錄波長(zhǎng)420nm處OD值在3min內(nèi)的變化。一個(gè)酶活性單位(U)定義為:在上述實(shí)驗(yàn)條件下，每分鐘引起OD值改變0.001所需的酶量。

1.2.3 酪氨酸酶活性測(cè)定方法 參照文獻(xiàn)［11-12］，并結(jié)合實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)加以修改，步驟如下:取洗凈的蘑菇子實(shí)體，用吸水紙吸干表面水分后稱取4.00g，將其切成小塊，加入10mL預(yù)冷的pH6.8的磷酸鹽緩沖液(含0.1mol/L NaF)中，冰浴研磨勻漿，然后在冷凍離心機(jī)中離心(4℃，5000r/min，20min)。測(cè)定參照蔣萌蒙等的方法進(jìn)行［13］，即在比色皿中分別加入3.9mL含1mmol/L L-酪氨酸的磷酸鹽緩沖液(pH6.8)，然后加入0.1mL酶液并迅速混勻，立即用紫外可見分光光度計(jì)在317nm處測(cè)定吸光值的變化，連續(xù)測(cè)定10min。以吸光率增加的最初直線段斜率來計(jì)算酶活力。酶活力單位(U)定義為:測(cè)定條件(20℃)下每分鐘引起OD值變化0.1為1個(gè)酶活力單位。

1.2.4 漆酶活性測(cè)定方法 參照潘迎捷等［14］，取4.00g菇子實(shí)體，加入 25mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH6.0)20mL混合，冰浴研磨，于4℃、8500r/min離心15min，取上清液待用。漆酶活性測(cè)定體系為:0.5mL 3.36mmol/L鄰聯(lián)甲苯胺，3.4mL 0.1mol/L醋酸緩沖液(pH=4.6)和0.1mL酶液，25℃反應(yīng)10min。酶活性以600nm吸光率的增值表示。一個(gè)酶活性單位(U)定義為:在上述實(shí)驗(yàn)條件下，每分鐘引起OD值改變0.1所需的酶量。

1.2.5 褐變度測(cè)定方法 采用DC-P3全自動(dòng)色差計(jì)。用標(biāo)準(zhǔn)陶瓷板(X=80.00，Y=83.00，Z=90.00)作為工作標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)量蘑菇子實(shí)體內(nèi)部組織切面及菌褶部切面的白度值。用L表示。L值越大，表示顏色越白，褐變?cè)捷p。L-0為黑色，L-100為白色。定義褐變度為相對(duì)于貯藏前白度值變化的百分率。計(jì)算公式如下:

褐變度(%)=(貯前白度值-貯后白度值)/貯前白度值×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚氧化酶活性測(cè)定結(jié)果

巨大口蘑和草菇PPO活性測(cè)定結(jié)果如表1。從表1可知，無論是新鮮的還是不同貯藏時(shí)間的巨大口蘑的PPO活性均明顯低于草菇的PPO活性，差異均達(dá)到了極顯著水平，如新鮮的巨大口蘑和草菇PPO活性分別為185.56、138.89U·mL-1·min-1·FW，貯藏4d后巨大口蘑PPO活性下降為97.78U·mL-1·min-1·FW;而草菇PPO活性上升達(dá)到峰值608.89U·mL-1·min-1·FW。此時(shí)草菇已開始褐變、腐爛。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，巨大口蘑PPO活性均維持較低水平，剛采摘的酶活性相對(duì)較高，達(dá)到了138.89U·mL-1·min-1·FW，然后迅速下降到一個(gè)最低水平85.33U·mL-1·min-1·FW，然后又開始緩慢上升，貯藏到第7d時(shí)酶活性為120U·mL-1·min-1·FW，但仍低于新鮮巨大口蘑的PPO活性。草菇PPO活性呈現(xiàn)迅速上升趨勢(shì)，貯藏到第4d已達(dá)到峰值，隨后略有下降，但貯藏7d后PPO活性仍比新鮮的高。

2.2 酪氨酸酶活性測(cè)定結(jié)果

巨大口蘑和草菇酪氨酸酶活性測(cè)定結(jié)果列入表2。從表2可知，巨大口蘑和草菇TYE活性差異達(dá)到極顯著水平，不同貯藏時(shí)期的巨大口蘑TYE活性均高于草菇TYE活性，兩者整體上都呈下降趨勢(shì)，0d時(shí)巨大口蘑和草菇TYE活性分別為0.56U·mL-1·min-1·FW和0.37U·mL-1·min-1·FW，貯藏到第7d時(shí)巨大口蘑和草菇TYE活性分別減小到0.32U·mL-1·min-1·FW 和 0.10U·mL-1·min-1·FW。

2.3 漆酶活性測(cè)定結(jié)果

巨大口蘑和草菇漆酶活性測(cè)定結(jié)果如圖1。由圖1顯示，巨大口蘑漆酶活性高于草菇漆酶活性，兩者差異極顯著。巨大口蘑漆酶活性整體上呈先增加后減小的趨勢(shì)，到第3d時(shí)達(dá)到最大值1.35U·mL-1·min-1·FW，然后開始下降。草菇漆酶活性在貯藏期間都維持在一個(gè)較低水平0.1U·mL-1·min-1·FW以下，且呈下降趨勢(shì)。草菇漆酶活性的變化很小。剛采摘時(shí)，巨大口蘑和草菇漆酶活性分別為0.39U·mL-1·min-1·FW 和0.07U·mL-1·min-1·FW;貯藏3d后，巨大口蘑漆酶活性達(dá)到峰值1.35U·mL-1·min-1·FW，草菇漆酶活性為0.04U·mL-1·min-1·FW。

2.4 褐變度測(cè)定結(jié)果

巨大口蘑和草菇褐變度結(jié)果如圖2。從圖2也可以看到巨大口蘑褐變比草菇緩慢得多，巨大口蘑貯藏7d后，褐變度僅為5.38%，而草菇貯藏7d后，褐變度已達(dá)到29.86%。從這一結(jié)果看出，兩種蘑菇的褐變度變化趨勢(shì)與它們的PPO活性變化趨勢(shì)是一致的。這是因?yàn)槟⒐胶肿冎饕怯啥喾友趸复呋M織中的酚類物質(zhì)氧化引起的［15］，所以PPO活性增強(qiáng)，這必將導(dǎo)致褐變速率加快。

表1 巨大口蘑和草菇PPO活性比較(U·mL-1·min-1·FW)

表2 巨大口蘑和草菇酪氨酸酶活性比較(U·mL-1·min-1·FW)

圖1 兩種菇漆酶活性隨貯藏時(shí)間的變化趨勢(shì)

圖2 不同貯藏時(shí)間巨大口蘑和草菇的褐變度

3 結(jié)論與討論

酶促褐變是酚酶催化酚類物質(zhì)形成醌及其聚合物的反應(yīng)過程。酶促褐變必須具備3個(gè)條件:酚類底物、酚氧化酶和氧。一般認(rèn)為，食用菌的酶促褐變主要是由于富含在組織中的PPO催化酚類物質(zhì)的氧化反應(yīng)所引起的［16-17］。

貯藏期間，巨大口蘑和草菇中三種褐變相關(guān)的酶活性比較表明:巨大口蘑PPO活性呈下降趨勢(shì)，草菇PPO活性呈上升趨勢(shì)且明顯高于巨大口蘑PPO活性，說明草菇的褐變與PPO活性密切相關(guān);巨大口蘑TYE活性略高于草菇TYE活性，且兩者變化都呈下降趨勢(shì);巨大口蘑的漆酶活性也高于草菇漆酶活性，草菇漆酶活性在整個(gè)貯藏期間走勢(shì)平緩，活性強(qiáng)度很低，說明漆酶不是引起草菇褐變的關(guān)鍵酶，這一結(jié)果與王樂芬等［5］研究雙孢蘑菇中漆酶的活性相似。從以上結(jié)果中，可以推斷漆酶和酪氨酸酶不是引起草菇褐變的主要催化酶，因?yàn)檫@兩種酶的活性都不高，且呈下降趨勢(shì);而草菇在貯藏期間PPO活性很高，褐變速度快，這一結(jié)果與榮瑞芬等［18］研究結(jié)果一致，由此推測(cè)可能是另外一種多酚氧化酶兒茶酚酶在草菇褐變中起了關(guān)鍵作用，這還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。巨大口蘑在貯藏中PPO活性低，且隨著貯藏期延長(zhǎng)，活性降低，褐變速度慢，因此推測(cè)巨大口蘑抗褐變性與其子實(shí)體中PPO活性低有關(guān)。另外，雖然巨大口蘑漆酶活性遠(yuǎn)比草菇的漆酶活性還高，但是巨大口蘑不容易褐變，而草菇很容易褐變，由此推測(cè)漆酶不是引起兩種蘑菇褐變的關(guān)鍵酶。酪氨酸酶是不是引起巨大口蘑褐變的關(guān)鍵酶，尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

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Study on browning and the activity of related enzyme of Vo/varie//a vo/vacen and Tricho/oma giganteum during storage

YANG Chun-min，MO Mei-hua*
(College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China)

TS201.2

A

1002-0306(2010)08-0320-04

2009-09-22 *通訊聯(lián)系人

楊春敏(1983-)，女，碩士研究生，研究方向:微生物資源開發(fā)與利用。