正交試驗(yàn)優(yōu)選狗肝菜中多糖提取工藝Δ

張可鋒，朱華，高雅，鄒登峰（.桂林醫(yī)學(xué)院，桂林市54004；.廣西中醫(yī)學(xué)院，南寧市53000）

狗肝菜為爵床科植物狗肝菜Dicliptera chinensis（L.）Nees的全草，其味苦、性寒，具有清熱、涼血、利尿、解毒等功效，臨床常用于治療熱病斑疹、便血、溺血、小便不利、腫毒疔瘡等證。有文獻(xiàn)報(bào)道，狗肝菜主要含有多糖、有機(jī)酸、氨基酸等物質(zhì)[1]，其中多糖具有保肝降酶的活性[2]，但對(duì)狗肝菜多糖的提取工藝研究國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用單因素和L9（34）正交試驗(yàn)法考察提取時(shí)間、溫度、次數(shù)和料液比對(duì)狗肝菜多糖得率的影響，以期為狗肝菜活性成分的進(jìn)一步研究與資源應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

UV-2550紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）。狗肝菜藥材采自廣西中醫(yī)學(xué)院藥用植物園，經(jīng)廣西中醫(yī)學(xué)院藥用植物教研室韋松基教授鑒定為真品。葡萄糖（廣東汕頭市西隴化工廠，批號(hào)：0703151）；苯酚、硫酸、乙醇、石油醚（30～60℃）、丙酮、乙醚及其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 狗肝菜多糖的提取

稱取干燥的狗肝菜全草粗粉100 g，加入適量石油醚脫脂，無(wú)水乙醇除雜，各回流提取2 h。藥渣揮盡乙醇后沸水提取2次，每次1.5 h，合并提取液，濃縮至100 mL，氯仿-正丁醇（4∶1）多次萃?。碨evag法），除去蛋白質(zhì)，加95%乙醇使醇含量達(dá)到80%，于4℃冰箱中醇沉12 h。抽濾，濾渣依次用乙醚、無(wú)水乙醇、丙酮洗滌，即得狗肝菜多糖。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖250 mg，蒸餾水溶解后定容至100 mL。準(zhǔn)確吸取此溶液1 mL，置于25 mL量瓶中 ，稀釋至刻度，搖勻（含葡萄糖100 μg·mL-1），備用。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL，置于具塞試管中，用蒸餾水補(bǔ)充至2 mL，以蒸餾水作空白，每管加入5%苯酚溶液1 mL，再垂直快速加入濃硫酸5 mL，搖勻，放置10 min，沸水加熱15 min，之后用流水速冷至室溫，于487 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A）。以檢測(cè)濃度（C）為橫坐標(biāo)，A為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A＝0.007 74C+0.036 38（r＝ 0.999 4）。結(jié)果表明，狗肝菜多糖檢測(cè)濃度在20～70 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.4 換算因子的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取多糖20 mg，溶于100 mL容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻。準(zhǔn)確吸取此溶液1 mL，置于具塞試管中，按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算多糖溶液中葡萄糖的濃度，按下式計(jì)算出換算因子：f＝W/（C·D）。式中，W為多糖質(zhì)量（mg）；C為多糖濃度（μg·mL-1）；D為稀釋倍數(shù)。

2.5 供試品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取生藥狗肝菜1 g，以石油醚脫脂，水煎煮法提取，醇沉、減壓干燥，按“2.9”項(xiàng)下方法提取操作。精密稱定各提取物質(zhì)量20 mg，然后加水定容至250 mL，作為樣品溶液。

2.6 多糖含量的測(cè)定[3]

精密吸取供試品溶液2 mL，置于具塞試管中，按苯酚-濃硫酸法，照“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，由回歸方程計(jì)算供試品溶液中葡萄糖濃度，按公式：含量（%）＝（C?D?f/W）×100%，計(jì)算供試品中多糖的含量；多糖得率（%）＝多糖含量×干燥提取物質(zhì)量（g）/原料質(zhì)量（g）。其中，C為樣品液中葡萄糖的濃度；D為稀釋因素；f為換算因子；W為樣品質(zhì)量。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取6份空白基質(zhì)各5 g，分別加入精制多糖10 mg，按“2.5”項(xiàng)下供試品溶液的方法制備和“2.3”項(xiàng)方法操作測(cè)定，測(cè)定吸光度，計(jì)算加樣回收率和RSD，結(jié)果分別為98.58%、2.19%。

2.8 精密度試驗(yàn)

取樣品液2 mL，按“2.3”項(xiàng)方法測(cè)定5次，測(cè)定吸光度，結(jié)果RSD＝0.51%。

2.9 試驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.9.1 單因素分析試驗(yàn) （1）提取時(shí)間對(duì)狗肝菜多糖得率的影響：以料液比1∶15、溫度90℃，提取2次，用85%的乙醇沉淀，不同的提取時(shí)間（1、1.5、2.0、2.5 h）多糖得率分別為2.30%、2.62、2.86%、2.87%?？梢?jiàn)提取2.0 h多糖得率相對(duì)較高，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖得率不再增加，考慮其狗肝菜中多糖的含量是一定的，在其它條件不變下延長(zhǎng)時(shí)間狗肝菜藥材中一些其它的成分會(huì)被提取出來(lái)，干擾多糖的檢測(cè)結(jié)果。（2）提取次數(shù)對(duì)狗肝菜多糖得率的影響：選擇不同提取次數(shù)（1、2、3），以1∶15的料液比，在90℃下提取2.0 h，用85%的乙醇沉淀，多糖得率分別為2.70%、2.98%、3.01%?？梢?jiàn)，提取3次多糖的得率相對(duì)較高，但提取2次和3次得率相差不多，從工藝及操作上考慮選擇提取2次。（3）提取溫度對(duì)多糖得率的影響：以料液比1∶15，提取2次，每次2.0 h，用85%的乙醇沉淀，不同的提取溫度（80、85、90、95℃）多糖得率分別為2.80%、2.83%、2.85%、2.86%。可見(jiàn)提取溫度90℃多糖得率相對(duì)較高，隨著溫度升高，多糖得率不再增加。（4）料液比對(duì)狗肝菜多糖得率的影響：選擇不同的料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25），溫度為 90 ℃，提取2次，每次2.0 h，用85%的乙醇沉淀，結(jié)果多糖得率分別為2.72%、2.81%、2.84%、2.86%?？梢?jiàn)隨著料液比增大，多糖得率不斷增加，在料液比1∶20以上時(shí)，多糖得率增加緩慢。（5）醇沉濃度對(duì)狗肝菜多糖得率的影響：以1∶20的料液比，在90℃下提取2次，每次2 h，選擇不同醇沉濃度（80%、85%、90%），結(jié)果多糖得率分別為3.08%、3.10%、3.10%。可見(jiàn)80%以上乙醇對(duì)狗肝菜多糖沉淀度影響不大。考慮節(jié)省原料，在工藝中選擇80%的乙醇沉淀即可。

2.9.2 正交試驗(yàn) 通過(guò)對(duì)提取時(shí)間、溫度、次數(shù)、料液比和醇沉濃度這5個(gè)因素進(jìn)行分析，根據(jù)單因素分析結(jié)果，從中選取提取時(shí)間（A）、提取次數(shù)（B）、提取溫度（C）、料液比（D）4個(gè)因素，采用L9（34）表進(jìn)行正交試驗(yàn)，以狗肝菜多糖得率為指標(biāo)確定最佳提取工藝。因素水平見(jiàn)表1；正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2；方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 因素水平Tab 1 Factors and levels

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Results of orthogonal test

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Results of variance analysis

由表2、表3可知，影響因素的主次順序?yàn)锳＞D＞B＞C，C為非主要因素，考慮能源，選擇提取溫度為85℃，故狗肝菜多糖最佳提取工藝為A3B2C1D3，即提取時(shí)間2 h，提取2次，溫度85 ℃，料液比1∶20。

2.9.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 按正交試驗(yàn)的優(yōu)化條件對(duì)3批狗肝菜藥材進(jìn)行提取工藝驗(yàn)證，結(jié)果多糖含量和得率的平均值分別為（5.12±0.11）%和（3.26±0.3）%。3次差異較小，工藝穩(wěn)定。

3 討論

本文測(cè)定多糖含量方法的原理是先用無(wú)水乙醇除去單糖、低聚糖及其它干擾性成分，再用水提醇沉法得到多糖。多糖在濃硫酸的作用下水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后和苯酚縮合成橙黃色化合物，且顏色穩(wěn)定，該化合物顏色深淺與糖的濃度成正比。因狗肝菜采收產(chǎn)地、季節(jié)等因素，其多糖含量會(huì)有差異，但多糖含量可作為其質(zhì)量控制的指標(biāo)之一。此外，今后應(yīng)加強(qiáng)以多糖為活性成分的藥理實(shí)驗(yàn)研究。

由于多糖在空氣中易氧化使顏色加深，故在過(guò)濾過(guò)程中分別依次用乙醚、無(wú)水乙醇、丙酮多次洗滌，消除了這種變化，而后真空干燥可得狗肝菜多糖。

[1]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1977：1 424.

[2]李海燕，王旭深.狗肝菜多糖保肝作用研究[J].中藥材，2006，29（8）：833.

[3]侯劍萍，王春霞.牛膝多糖的提取純化工藝研究[J].中國(guó)藥房，2008，19（36）：2 822.