2種鹽酸非索非那定制劑的人體生物等效性研究

王界永，高署，李見春，董海軍，姜威，石和鵬（.合肥合源醫(yī)藥科技有限公司，合肥市0088；.北京福瑞康正醫(yī)藥技術(shù)研究所，北京市 0009；.揚子江藥業(yè)集團北京海燕藥業(yè)有限公司，北京市 006）

鹽酸非索非那定是特非那定在人體的活性代謝產(chǎn)物，是組胺H1-受體拮抗藥，無抗膽堿和抗腎上腺素受體作用，屬于無鎮(zhèn)靜作用的第2代抗組胺藥[1]，用于治療季節(jié)性過敏性鼻炎及慢性特發(fā)性蕁麻疹，具有很好的臨床治療效果，且無催眠等中樞神經(jīng)不良反應(yīng)[2]。本研究建立了高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法測定健康人體內(nèi)非索非那定的血藥濃度，并以江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)的鹽酸非索非那定片為參比制劑，研究揚子江藥業(yè)集團北京海燕藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的鹽酸非索非那定口腔崩解片的人體相對生物利用度并評價其生物等效性。

1 材料

1.1 儀器

Finnigan TSQ Quantum Discovery Max型LC-MS/MS聯(lián)用儀，包括ESI離子源、Xcalibur1.4數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國菲尼根質(zhì)譜公司）；XS105分析天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；XW-80A微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器有限公司）；TGL-16H平衡離心機（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）；DZG-303A純水機（臺灣艾柯儀器廠）。

1.2 試藥

鹽酸非索非那定對照品（北京福瑞康正醫(yī)藥技術(shù)研究所，含量：99.8%）；磷酸可待因?qū)φ掌罚ㄖ袊幤飞镏破窓z定所，批號：171203-200303）；受試制劑：鹽酸非索非那定口腔崩解片（揚子江藥業(yè)集團北京海燕藥業(yè)有限公司，規(guī)格：60 mg，批號：2007051501）；參比制劑：鹽酸非索非那定片（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，規(guī)格：60 mg，批號：060905）；甲醇、甲酸均為色譜純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗方案

選取20名健康男性志愿者，年齡19～24歲，體質(zhì)量55～69 kg。無煙、酒嗜好，無神經(jīng)系統(tǒng)、精神異常及代謝異常等病史，血尿常規(guī)、肝腎功能及心電圖等檢查均正常，身體狀況良好。受試前2周至整個試驗期間禁煙、酒和禁服其它任何藥物。受試者均志愿簽署知情同意書，試驗方案經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準通過。采用按體質(zhì)量隨機交叉試驗設(shè)計。受試者按隨機原則分成2組，洗脫期為1周。20名受試者于清晨7∶00分別空腹口服受試制劑或參比制劑60 mg。受試制劑在受試者飲用200 mL溫開水后置于舌上，溶解或崩解后借吞咽動作入胃；參比制劑用200 mL溫開水送服。服藥2 h后方可再飲水，4 h后統(tǒng)一進食清淡飲食。服藥及取血期間均留在Ⅰ期臨床病房觀察。

2.2 血樣采集

服藥前取空白血，服藥后分別于0.08、0.17、0.33、0.5、0.75、1、2、3、4、6、12、24、48、72 h時從志愿者肘靜脈取血3 mL置抗凝管中，靜置30 min，4 000 r·min－1離心，取血漿1 mL，－20 ℃冰箱貯存，用于血藥濃度檢測。

2.3 血樣處理

精確量取血漿100 μL，加入740 ng·mL－1可待因內(nèi)標液10 μL，渦旋30 s，加入甲醇300 μL，渦旋3 min，14 000 r·min－1離心10 min，取上清液，再次離心5 min，進樣10 μL分析。

2.4 色譜及質(zhì)譜條件

色譜柱：Synergi POLAR-80R（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇∶水（含0.1%甲酸）＝85∶15；流速：50 μL·min－1；柱溫：30℃。

ESI離子源；噴霧電壓：4.7 kV；毛細管溫度：320℃；Skimmer offset：－8 V；鞘氣壓：35；輔助氣壓：4；正離子方式檢測；掃描方式：選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM）；用于定量的非索非那定m/z：母離子502.5，子離子170.9，碰撞能40 V；內(nèi)標可待因m/z：母離子300.1，子離子165.1，碰撞能38 V；掃描時間：0.5 s。

2.5 方法專屬性

量取混合空白血漿100 μL，按“2.3”項下方法自“渦旋30 s”起操作，得色譜圖1A；取688 ng·mL－1的鹽酸非索非那定對照品溶液10 μL，加入空白血漿100 μL中，按“2.3”項下方法操作，得色譜圖1B；取20號受試者第2周期口服受試制劑0.5 h后的血漿樣品，按“2.3”項下方法操作，得色譜圖1C。結(jié)果表明，非索非那定和內(nèi)標可待因的保留時間分別約為4.4、3.3 min，空白血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾非索非那定和內(nèi)標可待因的測定。

2.6 標準曲線的制備與定量下限考察

圖1 液-質(zhì)色譜圖Fig 1HPLC-MS/MS chromatogram

精密量取不同濃度的非索非那定對照品溶液各10 μL，加入空白血漿100 μL，配制成非索非那定血藥濃度分別為0.688、1.72、6.88、18、68.80、180、258 ng·mL－1的血漿樣品，按“2.3”項下方法操作，記錄待測物與內(nèi)標的峰面積，以待測物濃度（Y）為縱坐標，待測物與內(nèi)標的峰面積比值（X）為橫坐標，用加權(quán)法（W＝1/X2）進行回歸運算，求得的直線回歸方程為：Y＝23.278X+0.246（r＝0.998 0，n＝3）。結(jié)果表明，非索非那定血藥濃度在0.688～258 ng·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。血漿中非索非那定定量下限為0.688 ng·mL－1（S/N＞10）。

2.7 提取回收率試驗

取空白離心管，精密加入不同濃度的非索非那定對照品溶液各10 μL，再加入空白血漿100 μL，配制成非索非那定低、中、高（1.72、18、180 ng·mL－1）3種濃度的血漿樣品各3份，按“2.3”項下方法操作，記錄非索非那定藥物峰面積As（H）與內(nèi)標可待因峰面積Ai（H）；另取離心管加入空白血漿100 μL，加入甲醇300 μL，渦旋3 min，14 000 r·min－1離心10 min，取上清液，加入不同濃度的非索非那定對照品溶液及內(nèi)標溶液（740 ng·mL－1可待因）各10 μL，配制成相同濃度樣品，進樣10 μL分析，記錄非索非那定藥物峰面積As（D）和內(nèi)標可待因峰面積Ai（D），每一濃度進行3樣本分析，計算提取回收率（%）＝As（H）/As（D）×100%，結(jié)果見表1。

表1 提取回收率及精密度試驗結(jié)果（±s，n＝3）Tab1The results of extraction recovery and precision tes（t±s，n＝3）

表1 提取回收率及精密度試驗結(jié)果（±s，n＝3）Tab1The results of extraction recovery and precision tes（t±s，n＝3）

加入濃度/ng·mL－1 1.72±s/ng·mL－1日內(nèi)精密度實測濃度/ng·mL－1 1.77 1.45 1.72 15.53 18.89 16.94 189.31 163.35 172.32 x/%102.91 84.30 100.00 86.28 104.94 94.11 105.17 90.75 95.73 x日間精密度實測濃度/ng·mL－1 1.68 1.67 1.63 16.14 17.45 16.50 175.35 206.98 168.25 x RSD/%回收率/%±s/%RSD/%1.65±0.11 18 6.790.73±4.925.4 16.91±1.17 180/%97.67 97.09 94.77 89.67 96.94 91.67 97.42 114.99 93.47 6.989.10±8.039.0 179.26±16.179.0 89.30 86.68 96.20 80.84 89.59 96.86 88.56 87.58 85.57 87.23±1.521.8

2.8 精密度試驗

按“2.7”項下方法配制非索非那定低、中、高3種濃度的血漿樣品，按“2.3”項下方法操作，每一濃度進行3樣本分析，連續(xù)測定2 d，根據(jù)當日的標準曲線，計算血漿樣品的濃度。結(jié)果日內(nèi)和日間的RSD均小于15%，符合生物樣本測定的要求，詳見表1。

2.9 穩(wěn)定性試驗

按“2.7”項下方法配制非索非那定低、中、高3種濃度的血漿樣品，共7份，每一份樣品進行3樣本分析。4份按“2.3”項下方法操作，在室溫下放置0、4、8、23 h后進樣分析，考察處理后的血漿樣品在室溫條件下的穩(wěn)定性；1份在室溫下放置9 h后，按“2.3”項下方法操作，考察藥物在血漿中的室溫穩(wěn)定性；1份在－20℃冰箱反復(fù)凍融3次后，再按“2.3”項下方法操作，考察血漿樣品反復(fù)凍融穩(wěn)定性；1份在－20℃冰箱冷凍21 d后，按“2.3”項下方法操作，考察血漿樣品長期冷凍穩(wěn)定性。結(jié)果各穩(wěn)定性RSD均小于15%，表明處理后的血漿樣品中非索非那定及含藥血漿樣品在室溫、反復(fù)凍融以及長期冷凍條件下的穩(wěn)定性均較好。

2.10 藥-時曲線

20名健康志愿者隨機交叉口服60 mg鹽酸非索非那定口腔崩解片和鹽酸非索非那定片后，用LC-MS/MS法測得不同時間的非索非那定平均藥-時曲線。20名受試者口服受試制劑與參比制劑60 mg后平均藥-時曲線見圖2。

圖2 20名受試者口服受試制劑與參比制劑60 mg后平均藥-時曲線Fig 2 Mean concentration-time curves of fexofenadine in 20 healthy volunteers after oral administration of 60 mg test and reference tablets

2.11 藥動學(xué)參數(shù)及生物等效性評價

本試驗采用DAS ver 2.1軟件計算單劑量給藥后藥動學(xué)參數(shù)AUC0～72、AUC0～∞和Cmax等。20名受試者口服受試制劑與參比制劑60 mg后藥動學(xué)參數(shù)見表2。經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進行藥物間、周期間、個體間的三因素方差分析，再以雙向單側(cè)t檢驗進行等效性判斷。結(jié)果，鹽酸非索非那定口腔崩解片AUC0～72和AUC0～∞的90%置信區(qū)間分別為93.2%～121.1%和93.2%～120.9%，均在80%～125%范圍內(nèi)；Cmax的90%置信區(qū)間為94.5%～113.0%，在70%～143%范圍內(nèi)。藥物間、周期間、個體間方差分析結(jié)果顯示，2種制劑在藥物間和周期間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），2種制劑在個體間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。tmax采用非參數(shù)檢驗進行統(tǒng)計，結(jié)果P＞0.05，表明2種制劑在吸收程度和吸收速度上具有生物等效性。另根據(jù)公式：相對生物利用度（F）%＝AUC0～t（受試制劑）/AUC0～t（參比制劑）×100%計算鹽酸非索非那定口腔崩解片的相對生物利用度。結(jié)果F值為（112±36）%，在80%～125%內(nèi)，符合相對生物利用度的要求。

3 討論

本試驗經(jīng)過摸索確定了直接用甲醇沉淀去蛋白的LC-MS/MS法測定血漿中非索非那定的含量，表明該血樣處理方法相對文獻報道[3，4]具有操作更簡便、重復(fù)性好、應(yīng)用性更強的優(yōu)勢。

表2 20名受試者口服受試制劑與參比制劑60 mg后藥動學(xué)參數(shù)Tab2 Pharmacokinetic parameters of fexofenadine in 20 healthy volunteers after oral administration of 60 mg test and reference tablets

口腔崩解片是根據(jù)口腔的生理解剖特點設(shè)計的一種特殊片劑，不用水或用極少量水就能在口腔內(nèi)迅速崩解吸收，因而具有起效快、可以避免首關(guān)效應(yīng)等很多優(yōu)點，最主要的是服用方便，適用于有吞咽困難和老、幼年患者[5]。從本試驗結(jié)果看，試驗用鹽酸非索非那定口腔崩解片在口腔內(nèi)崩解時間短，僅（51.8±6.5）s，口感微甜。tmax差異雖然無統(tǒng)計學(xué)意義，但鹽酸非索非那定口腔崩解片的tmax比普通片小，表明鹽酸非索非那定口腔崩解片具有吸收快的優(yōu)勢。鹽酸非索非那定口腔崩解片相對普通片的生物利用度為（112±36）%，可能與鹽酸非索非那定口腔崩解片相對普通片具有無肝臟首關(guān)效應(yīng)的優(yōu)勢有關(guān)，但這仍有待進一步試驗確定。

本試驗健康成人口服60 mg受試制劑或參比制劑后，主要藥動學(xué)參數(shù)與文獻[4，6]報道接近。試驗統(tǒng)計結(jié)果表明，鹽酸非索非那定口腔崩解片與普通片具有生物等效性。

[1]Borade PS，Ballary CC，Currie GP，et al.Modern H1-antihistamines in asthma[J].Drug Discovery Today，2006，3（3）：253.

[2]Sun J，Lu R，F(xiàn)an XW，et al.The important roles of transpoter protein in drug delivery[J].Chin Pharm J，2007，42（3）：164.

[3]Ma L，Yin LL，Sun J，et al.A sensitive high performance liquid chromatography coupled with solid phase extraction for determination of fexofenadine in beagle plasma[J].Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences，2005，14（4）：246.

[4]Naoe Y，Zenzaburou T，Yuichi S，et al.Microdose clinical trial：Quantitative determination of fexofenadine in human plasma using liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry[J].Journal of Chromatography B，2007，858（1）：118.

[5]Hu XL，Huang H，Li YB，et al.The research development of orally disintergrating tablet[J].Chin J Hospital Pharm，2005，25（2）：167.

[6]Hofmann U，Seiler M，Drescher S，et al.Determination of fexofenadine in human plasma and urine by liquid chromatography-mass spectrometry[J].Journal of Chromatography B，2002，766（2）：227.