應(yīng)用組織芯片法檢測EGFR、COX-2在肺癌中的表達及生物學(xué)意義

朱叢中 劉娟 王新允

肺癌是一種嚴重威脅人類健康與生命安全的疾病，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升的趨勢。表明表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）在大多數(shù)實體腫瘤中高表達，可以促進腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移以及腫瘤血管生成[1]。環(huán)氧合酶-2 （cyclooxygenase-2,COX-2）在多種癌前病變、惡性腫瘤和轉(zhuǎn)移癌中的表達均異常升高，并且升高的水平與腫瘤的生長、侵襲和預(yù)后有關(guān)[2]。檢測兩者在肺癌中的表達及相關(guān)性，并探討它們與肺癌各臨床參數(shù)之間的關(guān)系，對肺癌的診斷、預(yù)后判斷和治療具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病例與標本 收集天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院及第二附屬醫(yī)院病理科1987年-2003年手術(shù)切除的肺癌石蠟包埋標本，其中原發(fā)肺癌89例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性肺癌12例，肺癌癌前病變12例?；颊咝g(shù)前均未行放療及化療。原發(fā)肺癌中包括腺癌35例，鱗癌33例，小細胞癌12例，大細胞癌9例；男性67例，女性22例；年齡33歲-78歲，平均年齡60.28±9.48歲；周圍型肺癌59例，中央型肺癌30例；高-中分化53例，低-未分化36例；I+II期56例，III+IV期33例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者48例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者41例。收集10例正常肺組織作為對照組。

1.1.2 試劑 兔抗人EGFR單克隆抗體（ZA-0505，工作液）、兔抗人COX-2單克隆抗體（ZA-0515，工作濃度1:80）、SP-9000試劑盒（包括封閉用山羊血清，生物素標記二抗和辣根酶標記鏈酶卵白素）和DAB顯色試劑盒購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 組織芯片制作 由于組織芯片技術(shù)是將數(shù)十或百個組織片排列于一張切片上，可以同時研究細胞形態(tài)、特定基因蛋白在樣本中的表達和功能狀態(tài)，并且實驗一次完成，實驗條件一致，大大降低了實驗誤差，增加了結(jié)果的可比性和可重復(fù)性，特別適用于臨床病理研究中，因此本次研究設(shè)計采用了該方法。制作方法如下：選取存檔蠟塊，切片，HE染色，病理專家復(fù)診，對蠟塊定位。美國Beecher陣列儀在受體蠟塊上按陣列圖打孔，組織芯直徑為0.6 mm，原發(fā)性肺癌和正常肺組織每例取2芯，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性肺癌和癌前病變每例取3芯。用穿刺針將標記好的供體組織芯取出，轉(zhuǎn)移到受體蠟塊相應(yīng)位置制成組織芯片蠟塊。采用3 μm切片[3]，切片后組織芯均勻排布于載玻片上，無脫片，也無明顯移位及扭曲。

圖 1 EGFR在肺癌組織中的表達（SP, ×200）Fig 1 The expression of EGFR protein in lung cancers (SP, ×200)

1.2.2 免疫組化SP法 切片脫蠟水化后，3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶10 min，0.1%枸櫞酸緩沖液（pH6.0-6.2）中微波修復(fù)20 min，山羊血清封閉15 min，滴加一抗，4oC冰箱過夜。第二天切片恢復(fù)室溫后，依次加入生物素化的二抗和辣根酶標記鏈酶卵白素，分別37oC下孵育30 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。滴加PBS取代一抗作為陰性對照。

1.2.3 結(jié)果判定 EGFR陽性表達位于細胞膜和細胞漿（圖1），COX-2定位于細胞漿（圖2）。根據(jù)免疫組化染色強度及陽性細胞數(shù)量進行半定量評分[4]，其中染色強度以多數(shù)細胞著色深淺計算：不著色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，深棕黃色為3分；陽性細胞數(shù)＜10%為0分，10%-45%為1分，46%-65%為2分，＞65%為3分；染色強度及陽性細胞數(shù)得分相乘，0為陰性（-），1分-2分為弱陽性（+），3分-4分為陽性（++），5分-6分為強陽性（+++）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)分析。各組陽性率的比較用χ2檢驗或Fisher確切概率法，各指標表達水平的比較采用非參數(shù)檢驗（Mann-Whitney檢驗或Kruskal-Wallis檢驗），EGFR和COX-2表達的相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

圖 2 COX-2在肺癌組織中的表達（SP, ×400）Fig 2 The expression of COX-2 protein in lung cancers (SP, ×400)

2.1 EGFR的表達情況 EGFR在各組的陽性表達率為原發(fā)性肺癌組59.6%（53/89），癌前病變組41.7%（5/12），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性肺癌組66.7%（8/12），正常肺組織組為10.0%（1/10），四組間EGFR的陽性表達率有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性肺癌組＞原發(fā)性肺癌組＞癌前病變組＞正常組。EGFR的表達在肺癌的組織學(xué)類型、臨床分期和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移各組間有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01），其中大細胞癌＞腺癌＞鱗癌＞小細胞癌，非小細胞癌＞小細胞癌，臨床III+IV期＞I+II期，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。EGFR的表達強度隨臨床分期的增加有上升的趨勢，合并分期后III+IV期高于I+II期（U=474.500, P＜0.001）。EGFR的陽性表達率與肺癌的大體類型、組織學(xué)分級、性別和年齡無關(guān)（P＞0.05）。見表1。

2.2 COX-2的表達情況 COX-2的陽性表達率為原發(fā)性肺癌組52.8%（47/89），癌前病變組41.7%（5/12），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性肺癌66.7%（8/12），正常組為0（0/10），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性肺癌組＞原發(fā)性肺癌組＞癌前病變組＞正常組，四組間的COX-2的陽性表達率有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）。COX-2的表達在肺癌的大體類型、組織學(xué)類型、臨床分期和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移各組間有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），其中周圍型肺癌＞中央型肺癌，大細胞癌＞腺癌＞鱗癌＞小細胞癌，非小細胞癌＞小細胞癌，臨床III+IV期＞I+II期，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。COX-2的表達強度隨臨床分期的增加有上升的趨勢，合并分期后III+IV期高于I+II期（U=680.500, P=0.026）。COX-2的陽性表達率與肺癌的組織學(xué)分級、性別和年齡無關(guān)（P＞0.05）。見表1。2.3 EGFR和COX-2表達的相關(guān)性 EGFR與COX-2在肺癌組織中的表達成正相關(guān)（rs=0.495, P＜0.01）。

表 1 EGFR和COX-2的表達及與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系Tab 1 Associations between expression of EGFR and COX-2 and clinicopathologic parameters

3 討論

EGFR是ErbB受體酪氨酸激酶家族的成員之一，它是一個分子量為170 kDa的單跨膜酪氨酸激酶，其編碼基因位于染色體7p13-q22，通過與相應(yīng)配體如表皮生長因子（epidermal growth factor, EGF）或轉(zhuǎn)化生長因子-α（transforming growth factor-α, TGF-α）結(jié)合，EGFR被活化，其與自身分子發(fā)生同二聚體化或與同家族的其它分子發(fā)生異二聚體化，導(dǎo)致EGFR胞漿部分的特定酪氨酸殘基磷酸化，并刺激下游信號傳導(dǎo)通路的活化，從而調(diào)控細胞的增殖、轉(zhuǎn)移、黏附、分化以及存活[5,6]。

文獻報道，在膀胱癌[7]、骨肉瘤[8]、膽道腫瘤[9]等多種實體瘤組織中存在EGFR基因的擴增或蛋白的高表達。本研究中EGFR在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性肺癌、原發(fā)性肺癌和癌前病變中高表達，在正常肺組織中低表達，提示EGFR與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切，其異常表達可能是肺癌發(fā)生的關(guān)鍵因素之一。最近的研究[10]表明肺腺癌中EGFR基因拷貝數(shù)增加和EGFR蛋白的過表達，此結(jié)果與我們的研究結(jié)果相符。因此檢測EGFR在肺癌中的表達情況對肺癌的臨床診斷有重要的指導(dǎo)作用。我們還發(fā)現(xiàn)EGFR的表達與肺癌的組織學(xué)類型密切相關(guān)，大細胞癌＞腺癌＞鱗癌＞小細胞癌，非小細胞癌高于小細胞癌，提示EGFR在肺癌中的過表達存在組織學(xué)特異性，不同組織學(xué)類型肺癌的發(fā)病機理可能不同，因而治療手段和方案也各異，這就為肺癌的診斷和針對性治療提供了一定的依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示晚期肺癌患者EGFR的陽性表達率高于早期患者，并且隨著臨床分期的增加EGFR水平增強。EGFR表達還與肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的表達率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。這些發(fā)現(xiàn)均提示EGFR與肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Kim等[11]報道EGFR是估計胃癌預(yù)后的獨立指標，過表達者主要為晚期患者，其緩解期和生存期都明顯短于陰性表達者。我們推測EGFR它可能通過增強瘤細胞增殖能力、調(diào)控腫瘤細胞的粘附、腫瘤性血管生成而促進肺癌轉(zhuǎn)移，對肺癌患者進行EGFR表達的檢測將有助于患者的預(yù)后評估。

COX-2是花生四烯酸合成前列腺素過程中的一個重要限素酶，研究[2]表明它與腫瘤的發(fā)生、進展、侵襲和血管生成密切相關(guān)。本研究顯示，COX-2在癌前病變組、原發(fā)性肺癌組和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性肺癌組中表達率依次升高，并明顯高于正常肺組織，提示COX-2可促進肺癌的發(fā)生和進展。尤其在非小細胞肺癌中COX-2呈高表達，小細胞肺癌中表達陰性，提示COX-2在非小細胞肺癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用。本研究結(jié)果還顯示周圍型肺癌中COX-2的表達水平明顯高于中央型肺癌組，其原因可能是周圍型肺癌多為大細胞癌和腺癌，中央型肺癌多為鱗癌。我們的結(jié)果也證實大細胞癌＞腺癌＞鱗癌，兩結(jié)果彼此相符。因此從肉眼類型也反映了不同類型肺癌中COX-2的作用不同，為不同類型肺癌的臨床診斷和治療提供了思路。本研究結(jié)果還顯示晚期患者以及伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者COX-2陽性表達率升高，并且COX-2的表達強度隨臨床分期的增加有上升的趨勢。文獻[12,13]報道COX-2的表達與腫瘤的分級、高增殖率、低凋亡指數(shù)有關(guān)，高表達患者預(yù)后較差。我們研究的結(jié)果和文獻報道一致，提示COX-2與肺癌的臨床進展密切相關(guān)，可作為預(yù)測預(yù)后的重要指標，臨床檢測COX-2的表達有助于患者治療方案的選擇和預(yù)后評估。

COX-2和EGFR的激活與調(diào)節(jié)均與絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）和磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K）等信號通路有關(guān)，通過這些信號通路COX-2和EGFR之間的關(guān)系似乎就建立起來。迄今為止，國內(nèi)外許多研究者[1,14]對兩者之間的關(guān)系作了一系列研究，發(fā)現(xiàn)COX-2和EGFR之間可能存在復(fù)雜的相互調(diào)控關(guān)系，COX-2可以被EGFR活化而激活，COX-2表達的增加可以增加前列腺素E2（prostaglandin E2, PGE2）的產(chǎn)生，而 PGE2可以轉(zhuǎn)而活化EGFR。Vallbohmer等[15]的研究結(jié)果證實，COX-2、EGFR和白細胞介素-8（interleukin-8, IL-8）的表達與西妥昔單抗（cetuximab，愛必妥）單一治療后患者總的生存率有關(guān)，三者低表達的患者存活時間明顯長于高表達者。我們通過對COX-2和EGFR進行檢測，發(fā)現(xiàn)兩者的表達呈正相關(guān)，結(jié)果與文獻報道一致。本研究結(jié)果顯示COX-2和EGFR均可以調(diào)節(jié)肺癌的發(fā)生和發(fā)展，并且兩者之間存在相互調(diào)控作用。因此，COX-2和EGFR在肺癌發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移過程中起重要作用，檢測EGFR和COX-2的表達有助于肺癌的臨床診斷和預(yù)后評估。