新一代基因測(cè)序技術(shù)及其在腫瘤研究中的應(yīng)用

陳琛 綜述 萬(wàn)海粟 周清華 審校

基因測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，為分子生物學(xué)的發(fā)展，起到了巨大的推動(dòng)作用。傳統(tǒng)的基因測(cè)序技術(shù)的重要代表，是所謂的Sanger測(cè)序法，這是一種以末端終止法為原理建立起來(lái)的技術(shù)[1]。20世紀(jì)90年代開始啟動(dòng)的人類基因組計(jì)劃，就是將Sanger測(cè)序法加以自動(dòng)化的改進(jìn)之后，通過大規(guī)模的國(guó)際合作，才最終完成的[2]。這項(xiàng)計(jì)劃，耗時(shí)十?dāng)?shù)年，直接花費(fèi)超過十億美元。顯然，高昂的測(cè)序成本，限制了基因測(cè)序技術(shù)的更常規(guī)的使用。近幾年，新一代基因測(cè)序技術(shù)（next-generation sequencing technology）的出現(xiàn)，則呈幾何級(jí)數(shù)地降低了基因測(cè)序的成本，在不遠(yuǎn)的將來(lái)，類似人類基因組規(guī)模的測(cè)序，預(yù)期只需要1 000美元就可以完成[3]。

新一代基因測(cè)序技術(shù)，由于測(cè)序成本的大幅度降低，使之能夠成為解決一般性的基因分子生物學(xué)問題的有效工具[4,5]。新一代基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，無(wú)疑也為腫瘤分子生物學(xué)的研究，提供了新的手段。本文將主要就新一代基因測(cè)序技術(shù)的特點(diǎn)和發(fā)展趨勢(shì)及其在腫瘤研究中的應(yīng)用，作簡(jiǎn)要的綜述。

1 新一代基因測(cè)序技術(shù)代表了生命科學(xué)技術(shù)發(fā)展的一種趨勢(shì)

對(duì)于一個(gè)經(jīng)典的生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)，其過程通常主要由三個(gè)部分組成，即：實(shí)驗(yàn)材料和試劑的準(zhǔn)備；生物反應(yīng)的進(jìn)行，對(duì)反應(yīng)結(jié)果的觀察和總結(jié)。將這一過程具體到傳統(tǒng)的Sanger基因測(cè)序法，即：序列片段和相關(guān)試劑的準(zhǔn)備，末端終止法測(cè)序反應(yīng)的進(jìn)行，通過電泳將序列片段分離并觀察結(jié)果。對(duì)這類經(jīng)典的生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)而言，通常第一和第二兩個(gè)步驟比較簡(jiǎn)單，而最耗時(shí)耗力的是第三步，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察。在傳統(tǒng)的基因測(cè)序法中，利用電泳將序列片段分離并觀察結(jié)果，是一個(gè)最影響測(cè)序效率的步驟。在人類基因組計(jì)劃實(shí)施的過程中，其所依賴的是對(duì)第三步實(shí)驗(yàn)過程的自動(dòng)化。但即使這樣，人類基因組的成本依然很高。

顯然，要想從根本上降低生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)的成本，就必須大大降低以上對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察的費(fèi)用，而要從根本上降低序列片段的分離和觀察的費(fèi)用。新一代基因測(cè)序技術(shù)所代表的，就是一個(gè)重要的方向：對(duì)實(shí)驗(yàn)反應(yīng)的信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察，從而避免了以上所說(shuō)的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)過程的第三個(gè)步驟的制約，而也正是這個(gè)特點(diǎn)，才使得測(cè)序成本能夠被大大的降低[6]。

2 新一代基因測(cè)序技術(shù)的基本原理

嚴(yán)格地說(shuō)，所謂新一代基因測(cè)序技術(shù)，并不是某種單一的技術(shù)，而是一個(gè)技術(shù)群。不同的新一代基因測(cè)序技術(shù)，在其原理上，還是有很大的差別的。目前，相對(duì)比較成熟、已經(jīng)市場(chǎng)化或者接近市場(chǎng)化的，主要有三家：Roche公司的454技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)以及ABI公司的SOLiD技術(shù)。它們則分別使用了不同的測(cè)序原理。

2.1 454測(cè)序原理 454測(cè)序技術(shù)主要應(yīng)用pyrosequencing原理：先使特異性的測(cè)序引物和單鏈DNA模板結(jié)合后，在多種酶，包括DNA聚合酶（DNA polymerase）、ATP硫酸化酶（ATP sulfurylase）、熒光素酶（luciferase）和雙磷酸酶（apyrase）以及底物APS和Luciferin等的共同參與下，將每一個(gè)dNTP的聚合與熒光信號(hào)的釋放偶聯(lián)起來(lái)。具體說(shuō)來(lái)則是當(dāng)向反應(yīng)體系中加入1種dNTP，如果它剛好能和DNA模板的下一個(gè)堿基配對(duì)，則會(huì)在DNA 聚合酶的作用下，添加到測(cè)序引物的3’末端，同時(shí)釋放出一個(gè)分子的焦磷酸（PPi）。在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS結(jié)合形成ATP；在熒光素酶的催化下，生成的ATP又可以和熒光素結(jié)合形成氧化熒光素，同時(shí)產(chǎn)生可見光。通過CCD光學(xué)系統(tǒng)即可獲得一個(gè)特異的檢測(cè)峰，峰值的高低則和相匹配的堿基數(shù)成正比。反應(yīng)體系中剩余的dNTP和殘留的少量ATP在Apyrase的作用下發(fā)生降解，這樣，就可以在反應(yīng)體系中，加入另一種dNTP，使以上反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行，根據(jù)獲得的峰值圖即可讀取準(zhǔn)確的DNA序列信息[7]（圖1）。

2.2 Solexa測(cè)序原理 Solexa測(cè)序技術(shù)，同樣是利用DNA聚合酶的鏈延伸反應(yīng)，只是所使用的dNTP，經(jīng)過了特殊的修飾，四種不同的dNTP分別被標(biāo)記上了不同的熒光基團(tuán)，同時(shí)，又在所有的dNTP中加入了3’末端保護(hù)基團(tuán)，即封閉基團(tuán)，以使每一步反應(yīng)只能延伸一個(gè)堿基，直到其熒光信號(hào)被收集后，將熒光基團(tuán)去除，再將封閉基團(tuán)去掉，從而進(jìn)行下一步反應(yīng)，而每步反應(yīng)所收集到的熒光信號(hào)，則對(duì)應(yīng)了所要檢測(cè)的序列。

在具體的實(shí)驗(yàn)操作中，通常是在待測(cè)序列片段的兩個(gè)末端加上含有特定序列的接頭，然后，再利用專利的芯片進(jìn)行：首先是待測(cè)序列在芯片上的原位擴(kuò)增，芯片表面含一層分別和待測(cè)片段兩個(gè)末端的特定序列對(duì)應(yīng)的兩個(gè)單鏈引物，可以通過互補(bǔ)原理，捕獲被變性成單鏈的待測(cè)片段，引物擴(kuò)增使得單鏈DNA成為雙鏈，該雙鏈變性后成為單鏈，其一端“固定”在芯片上，另外一端（5’或3’）隨機(jī)和附近的另外一個(gè)引物互補(bǔ)，被“固定”住，形成“橋”。這樣的反應(yīng)在上千萬(wàn)DNA單分子上發(fā)生，形成的單鏈橋以周圍的引物為擴(kuò)增引物，在芯片表面進(jìn)行擴(kuò)增，形成雙鏈。雙鏈經(jīng)變性成單鏈，再次形成橋，成為下一輪擴(kuò)增的模板繼續(xù)擴(kuò)增，經(jīng)過30輪擴(kuò)增，每個(gè)單分子得到了若干倍擴(kuò)增，成為單克隆“DNA簇群”。其次，是“DNA簇群”在Genome Analyzer綜合分析儀上進(jìn)行序列分析。如圖2所示，正如前面所提及，Solexa測(cè)序技術(shù)采用“可逆性末端終止反應(yīng)”進(jìn)行的；序列合成反應(yīng)體系包括有引物、DNA聚合酶、4種標(biāo)記了不同熒光的核苷酸，每個(gè)核苷酸的堿基被保護(hù)基團(tuán)封閉。每次反應(yīng)摻入一個(gè)核苷酸，該核苷酸類別可通過標(biāo)記熒光進(jìn)行識(shí)別，經(jīng)過掃描，讀取該次反應(yīng)顏色后，位于堿基3’末端的保護(hù)基團(tuán)被除去，繼續(xù)下一輪反應(yīng)，如此反復(fù)，得出片段的精確序列。該技術(shù)讀長(zhǎng)為30個(gè)-35個(gè)核苷酸[8]；不過，隨著技術(shù)的不斷改善，其讀長(zhǎng)會(huì)逐步增加。

2.3 SOLiD測(cè)序原理 SOLiD應(yīng)用連接法測(cè)序，同時(shí)利用了獨(dú)特的雙堿基編碼原理。待測(cè)的短的DNA片段的兩側(cè)，被連上SOLiD接頭，分別是P1接頭和P2接頭，然后，則對(duì)加上接頭的待測(cè)片段，在特定的磁珠表面進(jìn)行擴(kuò)增，具體則是通過油包水PCR反應(yīng)進(jìn)行的，其中，和P1接頭對(duì)應(yīng)的P1引物，被固定在P1磁珠的表面，在PCR反應(yīng)前，將含有PCR反應(yīng)所有成分（其中包括P1磁珠和對(duì)應(yīng)于P2接頭的P2引物等）的水溶液，注入高速旋轉(zhuǎn)的礦物油表面，水溶液就可以被分離成無(wú)數(shù)被礦物油包圍的小液滴，并各自構(gòu)成獨(dú)立的反應(yīng)空間，理想狀況下，每個(gè)小液滴只含一個(gè)DNA模板和一個(gè)P1磁珠，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，磁珠上就形成了若干具有相同來(lái)源的擴(kuò)增產(chǎn)物，這就為后續(xù)的測(cè)序反應(yīng)做好了準(zhǔn)備。

如圖3所示，測(cè)序反應(yīng)，是在前面制備的磁珠的基礎(chǔ)上進(jìn)行的；先使用一個(gè)測(cè)序引物，該測(cè)序引物與磁珠上的擴(kuò)增產(chǎn)物的P1接頭可以互補(bǔ)雜交，而如果在其鄰近的位置上，存在另一個(gè)互補(bǔ)鏈，則在測(cè)序引物和鄰近的互補(bǔ)鏈之間，可以進(jìn)行連接反應(yīng)；SOLiD系統(tǒng)使用了特殊的八個(gè)堿基長(zhǎng)的寡核苷酸鏈，其3’端第1、2位構(gòu)成的堿基對(duì)是表征探針染料類型的編碼區(qū)，5’末端標(biāo)有熒光染料，因此不同的序列組合就被標(biāo)記上不同的熒光基團(tuán)。寡核苷酸鏈競(jìng)爭(zhēng)性與測(cè)序引物鄰近的序列雜交連接，通過顏色判斷序列組成，當(dāng)其標(biāo)記顏色被讀取后，即將連接上的寡核苷酸在第五位和第六位之間切斷，以移除標(biāo)記，進(jìn)行下一輪反應(yīng)，依此循環(huán)。在第一輪反應(yīng)中，可以得到確定的堿基位點(diǎn)為：1、2、6、7、11、12位堿基等。重復(fù)該反應(yīng)過程，偏移一位堿基，使用較第一輪少一個(gè)堿基的引物進(jìn)行反應(yīng)，如此往復(fù)，直至整個(gè)序列讀序完成。此技術(shù)目前的讀長(zhǎng)為30個(gè)-35個(gè)堿基[9]。

以上可見，雖然這幾種測(cè)序技術(shù)在基本原理上有所不同，但都具有一個(gè)共同之處，即都使用了反應(yīng)信號(hào)的實(shí)時(shí)閱讀，在測(cè)序反應(yīng)進(jìn)行的同時(shí)，就將反應(yīng)信號(hào)收集起來(lái)。這樣，就幾乎將經(jīng)典的生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)所需要的第三步省略了，從而使得測(cè)序成本得到降低。

圖 2 Solexa測(cè)序原理示意圖Fig 2 Principle of solexa sequencing

圖 3 SOLiD測(cè)序原理示意圖Fig 3 Principle of SOLID sequencing

3 新一代基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展方向

以上所描述的，是幾種相對(duì)成熟的技術(shù)。但就人們對(duì)新一代基因測(cè)序技術(shù)的需求而言，這幾種技術(shù)，還遠(yuǎn)談不上完美。例如，454技術(shù)的樣品準(zhǔn)備過程過于復(fù)雜，Solexa技術(shù)的測(cè)序閱讀長(zhǎng)度還比較短，而SOLiD技術(shù)甚至還沒有得到科研群體的廣泛驗(yàn)證，這些具體的問題，都需要一一解決[10]，但這些技術(shù)所面臨的問題，許多是其測(cè)序原理所固有的。事實(shí)上，除這幾種技術(shù)外，許多依賴不同的原理的技術(shù)，也正在研究中，至少?gòu)哪壳翱矗鼈兊臐摿κ欠浅＞薮蟮摹?/p>

例如： AQI Sciences公司推出有關(guān)熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescent resonance energy transfer technologies, FRET）技術(shù)的系統(tǒng)平臺(tái)。這種技術(shù)可以通過設(shè)計(jì)出相應(yīng)的熒光標(biāo)記核酸探針，對(duì)靶DNA進(jìn)行均相定性定量測(cè)定。對(duì)于長(zhǎng)片段序列的測(cè)定，Agilent Laboratories公司也主要利用的是納米孔道技術(shù)（nanopore technology）。納米通道技術(shù)可以對(duì)基因快速測(cè)序，并且能多組分（高通量）快速檢測(cè)。最近，IBM公司改進(jìn)了這種技術(shù)，其方法是利用DNA晶體管來(lái)控制DNA在納米孔道中的運(yùn)動(dòng)，從而可以準(zhǔn)確讀出通過納米孔道的堿基對(duì)，達(dá)到精確測(cè)序的目的[11]。其它還有多家類似的從事高通量測(cè)序技術(shù)研究的公司或研究團(tuán)隊(duì)。例如：Helicos 推出了一種單分子測(cè)序技術(shù)，這種技術(shù)在測(cè)序時(shí)不再需要將基因組擴(kuò)增成上千個(gè)拷貝，而是只需要將一個(gè)拷貝的基因組打碎成30 bp左右的片段即可測(cè)序，因此大大減少了測(cè)序的費(fèi)用。這種技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于臨床檢測(cè)。有研究[12]將這些更具潛力的基因測(cè)序技術(shù)，稱為新新一代基因測(cè)序技術(shù)（next next-generation sequencing technology）。在改善測(cè)序技術(shù)的同時(shí)，人們同時(shí)也在關(guān)注如何更快更有效分析得到的大量數(shù)據(jù)[13]。例如，cDNA測(cè)序不僅確定表達(dá)水平，而且確定等位基因特異性的基因表達(dá)。Kofler等[14]建立PanGEA方法，就是利用454技術(shù)快速有效分析等位基因表達(dá)。PanGEA繪制454-est和基因或基因組對(duì)應(yīng)圖譜，顯示基因表達(dá)資料，單核苷酸多態(tài)性以及等位基因特異性表達(dá)的定量化。Hackenberg等[15]建立了miRanalyzer——一種分析小分子RNA測(cè)序結(jié)果的工具，可以用來(lái)檢測(cè)miRBase中所有已知的microRNA序列，找出所有最佳的轉(zhuǎn)錄序列，并且預(yù)測(cè)新的microRNAs。

技術(shù)的總的發(fā)展趨勢(shì)，是更少的樣品消耗、更高的通量、更長(zhǎng)的閱讀長(zhǎng)度、更準(zhǔn)確的測(cè)序結(jié)果、更低的成本[16]。相信在三到五年的時(shí)間內(nèi)，會(huì)有突破性的進(jìn)展出現(xiàn)。

4 新一代基因測(cè)序技術(shù)為大規(guī)模高通量的研究提供了可能

新一代基因測(cè)序技術(shù)，將許多從前無(wú)法實(shí)現(xiàn)的事情變成可能。如果說(shuō)當(dāng)年的人類基因組計(jì)劃是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)的話，現(xiàn)在，在新一代基因測(cè)序技術(shù)的基礎(chǔ)上，對(duì)不同物種基因組的測(cè)序，幾乎成為一個(gè)研究單位就可以決定的常規(guī)的行為[17,18]。2009年初，由中外科研單位共同提出的千人基因組計(jì)劃，也正式啟動(dòng)，其總體目標(biāo)，是繪制一張關(guān)于人類基因多態(tài)性的高分辨率的圖譜。

新一代基因測(cè)序技術(shù)，其在生命科學(xué)領(lǐng)域的主要影響，還在于使基因分子生物學(xué)的研究，獲得了一種大規(guī)模高通量的研究工具，這得在全基因組水平上，對(duì)組織細(xì)胞的分子機(jī)制的分析成為可能[19-21]。Zheng等[22]建立了多重的高通量管路以得到高質(zhì)量數(shù)據(jù)，并利用此方法對(duì)437個(gè)樣本外顯子的1 500個(gè)基因約5 Mb DNA重測(cè)序。

從對(duì)正常的發(fā)育過程的研究，到對(duì)不同病理狀況特征的研究，研究人員都能獲得更加全面數(shù)據(jù)[23-25]。這使得人類對(duì)生命現(xiàn)象的認(rèn)識(shí)，也從過去的單一過程的水平，進(jìn)入了整體的層次[26,27]。

5 新一代基因測(cè)序技術(shù)在腫瘤研究中的應(yīng)用

傳統(tǒng)上的腫瘤分子生物學(xué)的研究，開始是基本是對(duì)單一生物分子或者少數(shù)生物分子的分析，后來(lái)隨著技術(shù)的進(jìn)步，發(fā)展成為對(duì)單一分子過程或者少數(shù)分子過程的分析，后來(lái)，由于基因芯片的出現(xiàn)，使得高通量集成化的分析成為可能，而新一代基因測(cè)序技術(shù)，則為腫瘤的分子生物學(xué)的研究，提供了一種和基因芯片技術(shù)互為補(bǔ)充的新的高通量的工具[28,29]。新一代基因測(cè)序技術(shù)，對(duì)腫瘤分子生物學(xué)研究的影響是多方面的。

5.1 腫瘤基因組序列的再測(cè)序 高通量測(cè)序可以幫助研究者跨過文庫(kù)構(gòu)建這一實(shí)驗(yàn)步驟，避免了亞克隆過程中引入的偏差。 依靠后期強(qiáng)大的生物信息學(xué)分析能力，對(duì)照一個(gè)參比基因組（reference genome）高通量測(cè)序技術(shù)可以非常輕松完成基因組重測(cè)序（re-sequencing）[30-32]。進(jìn)而可以分析腫瘤基因組的拷貝數(shù)、多態(tài)性、不同類型的突變、基因相關(guān)性等[33]。

Gorlov等[34]利用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)了基因編碼區(qū)域上的83 715個(gè)SNP位點(diǎn)以確定肺癌的多態(tài)性敏感的變異體。在文中共分析了369例男性病例和287例對(duì)照例，確定了22q12.2區(qū)域，含有許多病例與對(duì)照不同的SNP位點(diǎn)，這個(gè)結(jié)果與在細(xì)胞系中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同。

5.2 全基因組基因表達(dá)譜的分析 Mortazavi等[35]人對(duì)小鼠的大腦、肝臟和骨骼肌進(jìn)行了RNA 深度測(cè)序，這項(xiàng)工作展示了深度測(cè)序在轉(zhuǎn)錄組研究上的兩大進(jìn)展，表達(dá)計(jì)數(shù)和序列分析。對(duì)測(cè)得的每條序列進(jìn)行計(jì)數(shù)獲得每個(gè)特定轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量，是一種數(shù)碼化的表達(dá)譜檢測(cè)，能檢測(cè)到豐度非常低的轉(zhuǎn)錄本。分析測(cè)得的序列，約90%的數(shù)據(jù)顯示落在已知的外顯子中，同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)了許多序列并不在已知的外顯子序列中，而那些在已知序列之外的信息，通過數(shù)據(jù)分析展示的是從未被報(bào)道過的RNA剪切（alternative splicing）、3’端非翻譯區(qū)、變動(dòng)的啟動(dòng)子（alternative promoter）以及潛在的小分子RNA前體，發(fā)現(xiàn)至少有3 500個(gè)基因擁有不止一種剪切形式。而這些信息用傳統(tǒng)技術(shù)是無(wú)法被發(fā)現(xiàn)的。

新一代高通量測(cè)序技術(shù)還被用于對(duì)基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的研究，例如，Balwierz等[36]利用高通量測(cè)序技術(shù)分析了122個(gè)樣本的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，構(gòu)建了人和鼠的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)圖譜，包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始簇和轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域三個(gè)層次。同樣，這項(xiàng)研究也是很難用傳統(tǒng)的方法實(shí)現(xiàn)的。

5.3 全基因組小分子RNA的分析 測(cè)序方法能輕易地解決芯片技術(shù)在檢測(cè)小分子時(shí)遇到的技術(shù)難題（短序列，高度同源）， 而且小分子RNA的短序列正好配合了高通量測(cè)序的長(zhǎng)度，使得數(shù)據(jù)“不浪費(fèi)”，同時(shí)測(cè)序方法還能在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)新的小分子RNA[37,38]。

5.4 全基因組層次上甲基化分析 近年來(lái)研究者不斷探索定性及定量檢測(cè)單個(gè)或多個(gè)甲基化位點(diǎn)的方法，但由于甲基化多態(tài)性區(qū)域存在的密度很高，所以對(duì)于常規(guī)的延伸反應(yīng)，其引物的位置很難設(shè)計(jì)。焦磷酸測(cè)序技術(shù)能夠快速地檢測(cè)甲基化的頻率，對(duì)樣品中的甲基化位點(diǎn)進(jìn)行定性及定量檢測(cè)[39,40]。用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)基因甲基化水平，常用重亞硫酸鹽將基因組DNA中的未甲基化的胞嘧啶修飾為尿嘧啶，甲基化的胞嘧啶則保持不變，在以后的PCR擴(kuò)增中，尿嘧啶將變成胸腺嘧啶，因此甲基化位點(diǎn)就成為一個(gè)普通的C/T單堿基多態(tài)性位點(diǎn)，其中等位基因 C的頻率即為基因甲基化的程度，這就可以通過測(cè)序的方法分析了。

White等[41]建立了針對(duì)Angelman綜合征和praderwilli綜合征srnpn基因甲基化檢測(cè)平臺(tái)，診斷率達(dá)到100%。Shaw等[42]在甲基化特異性PCR（methylation specific PCR, MSP）基礎(chǔ)上結(jié)合焦磷酸測(cè)序技術(shù)提出了甲基化強(qiáng)化焦磷酸測(cè)序技術(shù)（methylation enrichment pyrosequencing, MEP）改進(jìn)了常規(guī)的焦磷酸測(cè)序甲基化分析（pyrosequencing methylation assay, PMA）對(duì)10例口腔鱗狀細(xì)胞癌患者p16基因和細(xì)胞周期蛋白A1基因啟動(dòng)子進(jìn)行甲基化分析，結(jié)果顯示MEP對(duì)甲基化位點(diǎn)的檢出率明顯比PMA為高，與常規(guī) PMA不同的是，MSP引物是CpG位點(diǎn)特異性的，從而提高了檢測(cè)敏感度，減少了假陽(yáng)性結(jié)果。

Taylor等[43]利用454測(cè)序技術(shù)測(cè)序并分析40株細(xì)胞的25個(gè)CpG富集的基因，發(fā)現(xiàn)ALL和FL樣品的甲基化水平高于CLL和MCL，并且，在ALL和FL中甲基化從CpG島的外周到中心遞增散布。作者還通過同時(shí)分析基因組學(xué)和表觀遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，揭示了LRP1B啟動(dòng)子的單核苷酸多態(tài)性和甲基化水平之間的聯(lián)系。

5.5 染色體結(jié)構(gòu)的分析 在DNA-蛋白質(zhì)相互作用的研究上，染色質(zhì)免疫沉淀-深度測(cè)序（ChIP-seq）實(shí)驗(yàn)也展示了其非常大的潛力[44]。染色質(zhì)免疫沉淀以后的DNA直接進(jìn)行測(cè)序，對(duì)比ref seq可以直接獲得蛋白與DNA結(jié)合的位點(diǎn)信息，相比ChIP-chip，ChIP-seq可以檢測(cè)更小的結(jié)合區(qū)段、未知的結(jié)合位點(diǎn)、結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)的突變情況和蛋白親合力較低的區(qū)段[45]。和基因芯片一起，新一代基因測(cè)序技術(shù)，使人們能從整體的全基因組的層次上，認(rèn)識(shí)腫瘤的分子機(jī)制，為腫瘤的預(yù)防和治療，提供了新的基礎(chǔ)。

6 展望

如果說(shuō)基因芯片技術(shù)是基因分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的第一個(gè)高通量的研究技術(shù)的話，新一代基因測(cè)序技術(shù)，則同樣構(gòu)成了另一個(gè)重要的高通量的研究工具[46]。雖然還有許多問題需要解決，但這項(xiàng)技術(shù)，已經(jīng)為基因分子生物學(xué)的研究，帶來(lái)新的變化，而在腫瘤分子生物學(xué)的研究以及臨床應(yīng)用方面，也顯示了多方面的影響[47,48]。相信隨著測(cè)序通量的進(jìn)一步提高和測(cè)序成本的進(jìn)一步降低，新一代基因測(cè)序技術(shù)，將在腫瘤分子生物學(xué)領(lǐng)域，發(fā)揮更加重要的作用。