宣威女性肺癌患者肺組織中PAHS-DNA加合物的表達(dá)

楊凱云 黃云超 趙光強 雷玉潔 王昆

多環(huán)芳烴類物質(zhì)是公認(rèn)的化學(xué)致癌物之一。云南省宣威地區(qū)女性肺癌高發(fā)，其女性肺癌的平均調(diào)整死亡率高達(dá)120/10萬，宣威市來賓鎮(zhèn)女性肺癌死亡率甚至達(dá)到400/10萬人[1]，宣威地區(qū)室內(nèi)燃煤污染被認(rèn)為是宣威地區(qū)女性肺癌高發(fā)的主要原因之一，燃煤產(chǎn)生的大量多環(huán)芳烴物質(zhì)可能是當(dāng)?shù)嘏苑伟┌l(fā)病的主要危險因素。研究[2]表明宣威地區(qū)燃煤家庭室內(nèi)空氣中苯并芘濃度比衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)許濃度（0.1 μg/100m3）高很多，最高達(dá)到626 μg/100m3，超過衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)6 000多倍，當(dāng)?shù)貗D女主要從事家務(wù)勞動，長期在煤煙污染中生活，受多環(huán)芳烴類物質(zhì)影響尤為嚴(yán)重。我們采用免疫熒光（immunofluorescence）方法檢測宣威女性肺癌患者、宣威男性肺癌患者、非宣威女性肺癌患者以及肺良性病變患者肺組織中多環(huán)芳烴DNA加合物表達(dá)的差異，探討多環(huán)芳烴類物質(zhì)與宣威女性肺癌的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 ①實驗組：收集2007年7月-2008年11月云南省腫瘤醫(yī)院胸心血管外科及胸外科經(jīng)手術(shù)切除的宣威地區(qū)女性肺癌患者癌組織、癌旁組織（距癌組織邊緣的距離＜5 cm）和正常肺組織（距癌組織邊緣的距離＞5 cm）各20份。其中鱗癌6例，腺癌14例，年齡為31歲-72歲，平均為52.1歲；②對照組1：同期收集宣威地區(qū)男性肺癌患者癌組織、癌旁組織和正常肺組織各20份。其中鱗癌13例，腺癌7例，年齡為35歲-74歲，平均為55.7歲；③對照組2：同期收集非宣威地區(qū)女性肺癌患者癌組織、癌旁組織和正常肺組織各20份。其中鱗癌8例，腺癌12例，年齡為36歲-68歲，平均為54.3歲，患者來自昭通、寶山、昆明、麗江以及貴州盤縣等地區(qū)；④對照組3：同期收集宣威地區(qū)女性肺良性病變患者正常肺組織10例。年齡為29歲-61歲，平均為53.7歲；⑤對照組4：同期收集非宣威地區(qū)女性肺良性病變患者正常肺組織10例。年齡為32歲-63歲，平均為54.2歲，患者來自昆明、大理、玉溪等地區(qū)。

全部病例均進(jìn)行問卷調(diào)查，包括性別、年齡、居住情況、生活習(xí)慣、燃煤情況、房屋住宅情況、飲食習(xí)慣、家庭經(jīng)濟(jì)情況等，并復(fù)印患者胸片、B超、CT，以及纖維支氣管鏡、痰查細(xì)胞學(xué)檢查、術(shù)后病檢結(jié)果。所有病例均不吸煙，也未進(jìn)行過放療及化療。

1.2 方法 ①手術(shù)取患者癌組織、癌旁組織、正常肺組織放置于-80oC冰箱保存；②組織脫水，透明，浸蠟，常規(guī)石蠟切片機切片：厚度為3 μm；③切片采用免疫熒光法染色，并進(jìn)行熒光顯微鏡攝片及圖片分析。（一抗：苯并芘共價加合物單克隆抗體Benzo[a]pyrene(BAP-13):sc-51508；熒光二抗：羊抗鼠IgG-FITC: sc-2010。均購自美國Santa Cruz公司）。

1.3 結(jié)果判斷 PAH-DNA加合物在熒光顯微鏡下表現(xiàn)為綠色明亮的熒光，主要存在于細(xì)胞核，部分存在于細(xì)胞質(zhì)。根據(jù)熒光強度分為：①強陽性（+++）：熒光閃亮，呈現(xiàn)明顯的亮綠色；②中度陽性（++）：熒光明亮，呈黃綠色；③弱陽性（+）：熒光較弱，但清楚可見；④陰性（-）：無熒光可見。

1.4 半定量測定 用IPP 6.0軟件進(jìn)行圖像分析。把圖像中呈現(xiàn)黃色熒光區(qū)域作為AOI（area of interest）進(jìn)行光密度測定分析。選擇測量面積（area）平均光密度（density mean）和累積光密度（integrated optical, IOD），結(jié)果以IOD值作為統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

1.5 統(tǒng)計方法 應(yīng)用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行卡方檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宣威地區(qū)女性肺癌患者與宣威地區(qū)男性肺癌患者肺組織中多環(huán)芳烴DNA加合物的表達(dá) 多環(huán)芳烴DNA加合物在細(xì)胞中主要表達(dá)于細(xì)胞核，部分表達(dá)與細(xì)胞質(zhì)，其在宣威女性肺癌患者肺組織中的表達(dá)較宣威男性肺癌患者高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

2.2 宣威地區(qū)女性肺癌患者與非宣威地區(qū)女性肺癌患者肺組織中多環(huán)芳烴DNA加合物的表達(dá) 多環(huán)芳烴DNA加合物在宣威女性肺癌患者肺組織中的表達(dá)較非宣威女性肺癌患者高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

2.3 正常肺組織中多環(huán)芳烴DNA加合物的表達(dá) 多環(huán)芳烴DNA加合物在宣威女性正常肺組織中表達(dá)較高，在宣威男性、非宣威女性中的表達(dá)較低（表3）。

2.4 多環(huán)芳烴DNA加合物在癌組織、癌旁組織、正常組織中的表達(dá)趨勢 PAH-DNA加合物在癌組織、癌旁組織、正常組織中的表達(dá)有逐漸降低的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表4，圖1）。

3 討論

近年來女性肺癌發(fā)病率、死亡率有逐年增高趨勢，在許多國家其增幅甚至高于男性。中國云南省宣威地區(qū)一直是女性肺癌的高發(fā)區(qū)，其女性肺癌死亡率高達(dá)120/10萬，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于中國女性平均水平（22.9/10萬），而宣威來賓鎮(zhèn)虎頭村女性肺癌死亡率竟達(dá)到400/10萬人。

表 1 多環(huán)芳烴DNA加合物在宣威女性及男性肺癌患者肺組織中的表達(dá)Tab 1 The expression of PAH-DNA adducts in lung cancer tissues of Xuanwei female and male patients

表 2 多環(huán)芳烴DNA加合物在宣威女性及非宣威女性肺癌患者肺組織中的表達(dá)Tab 2 The expression of PAH-DNA adducts in lung tissues of Xuanwei female and Non-Xuanwei female patients

表 3 多環(huán)芳烴DNA加合物在正常肺組織中的表達(dá)Tab 3 The expression of PAH-DNA adducts in lung normal tissues

表 4 多環(huán)芳烴DNA加合物在癌組織、癌旁組織、正常組織中的表達(dá)趨勢Tab 4 The expression of PAH-DNA adducts in cancer, adjacent and nomal tissues

腫瘤是DNA損傷后修復(fù)失敗或修復(fù)出錯的結(jié)果，無論是內(nèi)源性還是外源性的致癌物，幾乎均需要經(jīng)過這一共同的關(guān)鍵步驟才能起致癌作用。而機體暴露于化學(xué)致癌物后所致的DNA損傷，最普遍、最重要的表現(xiàn)形式是DNA加合物。

每燃燒1 kg煤產(chǎn)生多環(huán)芳烴類物質(zhì)可達(dá)6×105/μg-14×105/μg[3]。多環(huán)芳烴進(jìn)入機體后經(jīng)細(xì)胞色素P450和環(huán)氧化物水解酶、單加氧酶等代謝過程產(chǎn)生反式二羥環(huán)氧苯并芘（anti_benzo(a)pyrenediol_epoxide, BPDE），BPDE是直接的強致癌物，可以和DNA共價結(jié)合形成多環(huán)芳烴_DNA加合物（polycylic aromatic hydrocarbons adduct, PAHDNA adduct），或與蛋白質(zhì)結(jié)合形成多環(huán)芳烴蛋白加合物。當(dāng)基因復(fù)制到多環(huán)芳烴_DNA加合物位點時，則不能繼續(xù)復(fù)制，還可能發(fā)生突變或堿基缺失。多環(huán)芳烴蛋白加合物則通過反式作用因子來影響DNA復(fù)制及轉(zhuǎn)錄。當(dāng)關(guān)鍵基因突變導(dǎo)致細(xì)胞失去正常調(diào)控時，就會引起細(xì)胞癌變[4]。多環(huán)芳烴與其它毒物一樣，在體內(nèi)要經(jīng)過代謝活化，產(chǎn)生生物活性，并經(jīng)過代謝失活，排出體外。因此，代謝酶活性的強弱對多環(huán)芳烴的生物效應(yīng)影響很大。PAH-DNA加合物不僅能反映出人體總的多環(huán)芳烴接觸量，還能反映出多環(huán)芳烴經(jīng)人體代謝后致突變作用的實際含量，因此PAH-DNA加合物既是多環(huán)芳烴的接觸指標(biāo)，又是其致癌作用的效應(yīng)指標(biāo)[5]。

圖 1 PAH-DNA加合物的表達(dá)（×400）。A：宣威女性肺癌癌組織；B：宣威女性肺癌癌旁組織；C：宣威女性肺癌正常肺組織；D：宣威男性肺癌癌組織；E：宣威男性肺癌癌旁組織；F：宣威男性肺癌正常肺組織；G：非宣威女性肺癌癌組織；H：非宣威女性肺癌癌旁組織；I：非宣威女性肺癌正常肺組織；J：宣威女性肺良性病變患者肺組織；K：非宣威女性肺良性病變患者肺組織。Fig 1 The expression of PAH-DNA adducts (×400). A: Tumor tissue of Xuanwei female lung cancer patient; B: Adjacent tumor tissue of Xuanwei female lung cancer patient; C: Normal tissue of Xuanwei female lung cancer patient; D: Tumor tissue of Xuanwei male lung cancer patient; E:Adjacent tumor tissue of Xuanwei male lung cancer patient; F: Normal tissue of Xuanwei male lung cancer patient; G: Tumor tissue of Non-Xuanwei female lung cancer patient; H: Adjacent Tumor tissue of Non-Xuanwei female lung cancer patient; I: Normal tissue of Non-Xuanwei female lung cancer patient; J: Normal tissue of Xuanwei female patient with benign lung lesion; K: Normal tissue of Non-Xuanwei female patient with benign lung lesion.

多環(huán)芳烴類物質(zhì)與肺癌的關(guān)系國內(nèi)外都已經(jīng)研究得很多，但云南宣威地區(qū)卻有其特殊性。宣威地區(qū)女性幾乎不吸煙，但其肺癌發(fā)病率卻非常高，某些地區(qū)甚至超過男性。現(xiàn)認(rèn)為主要與當(dāng)?shù)氐氖覂?nèi)燃煤污染有關(guān)。

宣威市位于滇東北部烏蒙山區(qū)，是云南省主要產(chǎn)煤基地，小煤窯遍及全縣，農(nóng)民世世代代在室內(nèi)挖坑為爐，多數(shù)家庭燃燒煙煤取暖做飯，爐子溫度不高，不能完全燃燒煤炭，加之室內(nèi)通風(fēng)不良，當(dāng)?shù)嘏蚤L年累月在煙霧中生活，受燃煤污染影響特別嚴(yán)重。相對室外來說，室內(nèi)通風(fēng)不暢可導(dǎo)致燃煤空氣污染比室外高出幾十甚至上百倍。WHO公布，柏林市中心空氣中可吸入顆粒物（particles with diameters of 10 μm or less, PM10）濃度為30 μg/m3，Bangkok路邊空氣中PM10濃度為240 μg/m3，而直接用火塘燃煤的室內(nèi)空氣中PM10濃度高達(dá)3 000 μg/m3[6]。云南省疾病預(yù)防控制中心監(jiān)測的結(jié)果發(fā)現(xiàn)：70%的時間段，宣威地區(qū)戶外空氣質(zhì)量水平達(dá)國家標(biāo)準(zhǔn)[7]。然而燃煙煤農(nóng)戶室內(nèi)空氣中BaP濃度高達(dá)626 μg/100m3，超過其建議衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)6 000多倍，同時也遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過焦?fàn)t頂工人暴露水平[8]。

藍(lán)青、何興舟等[9]研究發(fā)現(xiàn)：云南宣威地區(qū)煤層屬于晚二疊紀(jì)煤層，煤炭品種分類為煙煤。宣威地區(qū)煙煤燃燒產(chǎn)生的空氣懸浮顆粒物較無煙煤多，并且這些空氣懸浮顆粒物中有機物含量（占43%）也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于無煙煤，這些有機物大部分為多環(huán)芳烴類物質(zhì)[10]。宣威肺癌死亡率分布也呈現(xiàn)明顯的地區(qū)差異，肺癌死亡率高低與使用燃料品種有關(guān)。燒煙煤死亡率最高，木柴、無煙煤次之。肺癌死亡率性別比值（男:女）各地差異較大，荷蘭為13.5:1，美國為1.8:1，中國為2.07:1，云南宣威地區(qū)為1.09:1，宣威來賓鎮(zhèn)為0.87:1。燒煙煤人群肺癌死亡年齡高峰提前，燒煙煤人群肺癌死亡率是非燒煙煤人群的1.70倍[11]。

宣威地區(qū)流行病學(xué)研究[12]發(fā)現(xiàn)：燒煙煤人群患肺癌危險性是非燒煙煤人群的6.05倍（OR=6.05）?；仡櫺躁犃醒芯縖13]發(fā)現(xiàn)：女性中燒煙煤人群肺癌死亡率是非燒煙煤人群肺癌死亡率的25.6倍（RR=25.6），歸因百分比為96%。暴露劑量反應(yīng)關(guān)系研究[14]發(fā)現(xiàn)：伴隨1958年前燒煙煤人口百分比升高（0%-100%）肺癌年齡調(diào)整死亡率相應(yīng)升高（2.08/105-174.21/105）；伴隨室內(nèi)空氣中BaP濃度升高（356.0 ng/m3-2 485 ng/m3）肺癌死亡率相應(yīng)升高（2.08/105-174.21/105）。

研究發(fā)現(xiàn)：多環(huán)芳烴代謝酶多態(tài)性對宣威地區(qū)女性影響也較男性大。GSTM1在日本、歐洲和北美人群中表達(dá)的比例高達(dá)40%-50%，在中國為35%-63%，在云南省宣威市女性人群中為34.2%，其相對危險度為2.39（1.25-4.56），高于男性[15]。

室內(nèi)燃煤空氣中以苯并（a）芘為代表的大量致癌性多環(huán)芳烴類物質(zhì)可能是宣威女性肺癌發(fā)病的主要危險因素之一，多環(huán)芳烴代謝酶的基因多態(tài)性可能是宣威地區(qū)女性肺癌發(fā)生發(fā)展的遺傳因素，這與我們研究的結(jié)果相符合?，F(xiàn)在，宣威地區(qū)女性肺癌發(fā)病仍然呈增高趨勢，而且還呈年輕化趨勢，我們收治的宣威肺癌患者中，20多歲的人群屢見不鮮。我們認(rèn)為，通過研究宣威地區(qū)女性肺組織中多環(huán)芳烴DNA加合物的表達(dá)，可以幫助我們進(jìn)一步了解當(dāng)?shù)胤伟└甙l(fā)與燃煤污染、多環(huán)芳烴類物質(zhì)污染的關(guān)系，并指導(dǎo)制定進(jìn)一步的預(yù)防措施。