樹突狀細(xì)胞的體外培養(yǎng)及其抗癌作用

馬昌云 吳芳 孔繁義 周文艷

以往通過直接輸入效應(yīng)細(xì)胞或與免疫佐劑聯(lián)合輸入至體內(nèi)以效應(yīng)細(xì)胞形式用于抗腫瘤免疫治療，由于存在抗原在體內(nèi)不能被有效提呈或單純的效應(yīng)細(xì)胞在體內(nèi)不能大量增殖等缺陷，所以它們的應(yīng)用均受到限制。因而改變和促進(jìn)免疫系統(tǒng)對腫瘤抗原的提呈以誘導(dǎo)有效的抗瘤免疫效應(yīng)，成為腫瘤免疫治療中具有實(shí)際價(jià)值的研究方向。樹突狀細(xì)胞（dendritic cells, DC）是人體內(nèi)最有效的抗原遞呈細(xì)胞（antigen presenting cell, APC），金黃色葡萄球菌腸毒素A （staphylococcal enterotoxin A, SEA）是一種外源性超抗原（superantigen, SAg），具有高效刺激T細(xì)胞增殖、增強(qiáng)免疫功能等生物學(xué)活性。我們從外周血單個(gè)核細(xì)胞中聯(lián)合應(yīng)用細(xì)胞因子誘導(dǎo)獲得較高純度的成熟DC，采用功能最強(qiáng)的APC即DC作為瘤苗載體，以肺癌腫瘤可溶性抗原（tumor soluble antigen, TSA）及超抗原SEA體外沖擊致敏DC并誘導(dǎo)活化T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生了相對高效而特異的抗癌免疫效應(yīng)。為臨床應(yīng)用研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌細(xì)胞株GLC-82、人紅白血病細(xì)胞株K562（中國科學(xué)院腫瘤研究所）。hGM-CSF、hIL-4、hIL-2、hTNF-α（美國PEPRO TECH公司），鼠抗人CD3-FITC、CD8- FIT、CD14-FITC、CD1a-FITC、HLA-DR、CD80-FITC（北京中山公司），羊抗鼠IgG-FITC（Santa Cruz Bio-Tech公司），S-100蛋白染色試劑盒（SABC法，美國ZYMED公司），RPMI-1640、胎牛血清（FBS，GIBCO公司），胰蛋白酶、淋巴細(xì)胞分離液（Sigma公司），考馬斯亮蘭R250（Fluka公司），四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT，Sigma公司），二甲基亞砜（DMSO，Amresso公司），超抗原SEA（北京邦定公司）。

1.2 方法

1.2.1 肺癌可溶性抗原提取 用3 mol/L KCl法提取人肺腺癌GLC-82細(xì)胞可溶性抗原：取5×108個(gè)人肺腺癌GLC-82細(xì)胞，PBS溶液洗滌，1 000 r/min離心15 min，5倍體積的3 mol/L KCl 4oC震蕩過夜，液體透析，12 000 r/min離心30 min，取上清。考馬斯亮蘭法測定可溶性抗原蛋白多肽含量。

1.2.2 DC的體外培養(yǎng)擴(kuò)增與鑒定 取健康成人外周抗凝全血50 mL，用淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心，常規(guī)獲取單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC），調(diào)細(xì)胞濃度為2×106/mL，加入24孔板置于5%CO2、37oC孵箱中培養(yǎng)2 h，洗除非貼壁細(xì)胞，每孔加入終濃度為100 ng/mL的GM-CSF、50 ng/mL的IL-4及含10%FBS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基1 mL，培養(yǎng)擴(kuò)增，于第5天加入終濃度為100 ng/mL的TNF-α，第7天收集DC細(xì)胞。光學(xué)、倒置相差顯微鏡及電鏡形態(tài)學(xué)觀察，SABC免疫細(xì)胞化學(xué)染色法觀察DC細(xì)胞形態(tài)。用FCM分析檢測DC表型。

1.2.3 肺癌TSA和超抗原SEA修飾致敏DC 于DC培養(yǎng)的第5天，將制備的人肺腺癌GLC-82細(xì)胞可溶性抗原以終濃度50 ng/mL和超抗原SEA以終濃度50 μg/L加入實(shí)驗(yàn)組DC中，以此建立負(fù)載肺癌TSA和超抗原SEA的DC，同時(shí)設(shè)有未加SEA的TSA-DC對照組、未加TSA的SEA-DC對照組和未加TSA、SEA的DC對照組。

1.2.4 T淋巴細(xì)胞的分離培養(yǎng)與誘導(dǎo)活化 用尼龍棉柱法分離獲得T淋巴細(xì)胞：按前述方法獲得的非貼壁PBMC調(diào)細(xì)胞濃度為2×106/mL；將該細(xì)胞懸液加在尼龍棉柱上，孵箱培養(yǎng)30 min；RPMI-1640培養(yǎng)基洗脫尼龍棉柱，收集細(xì)胞懸液為T淋巴細(xì)胞。經(jīng)FCM鑒定T細(xì)胞表型。以上得到的各組致敏DC按DC:T淋巴細(xì)胞分別為1:10的比例混合培養(yǎng)。倒置顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)、大小、數(shù)量等變化。至第7天收集活化的T淋巴細(xì)胞即CTL。各組作為效應(yīng)細(xì)胞分別稱為TSA-SEA-DCL、TSA-DCL、SEA-DCL、DCL 。

1.2.5 靶細(xì)胞殺傷試驗(yàn) 以上各組作為效應(yīng)細(xì)胞，以人肺腺癌細(xì)胞GLC-82、人紅白血病細(xì)胞K562作為靶細(xì)胞，效靶比按50:1共同培養(yǎng)12 h，用MTT顯色法測定實(shí)驗(yàn)孔和對照孔570 nm處光密度（oplical Density, OD）值并計(jì)算殺傷率。殺傷率=[單獨(dú)靶細(xì)胞OD值+單獨(dú)效應(yīng)細(xì)胞OD值-實(shí)驗(yàn)孔OD值]/單獨(dú)靶細(xì)胞OD值 ×100%。鏡下觀察效應(yīng)細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷過程。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 10. 0版軟件行t檢驗(yàn)和方差分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Mean±SD表示，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

圖 1 培養(yǎng)的DC細(xì)胞形態(tài)變化。A：培養(yǎng)2 h后貼壁生長的PBMC（即DC的前體細(xì)胞）（倒置相差顯微鏡，×200）；B：培養(yǎng)第7天的DC：細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，可見突起，胞體大，胞質(zhì)顆粒增加（倒置相差顯微鏡，×400）；C：S-100蛋白免疫染色，示培養(yǎng)第7天的DC細(xì)胞有棕黃色顆粒的陽性染色（光學(xué)顯微鏡，×400）；D：電鏡下的DC：細(xì)胞有許多長短不一的突起，核大而不規(guī)則，染色質(zhì)豐富，胞質(zhì)內(nèi)有較多線粒體（透射電鏡，×8 000）。Fig 1 Morphological changes of cultured DC. A: After 2 h cultured adherent growth of PBMC (ie DC precursor cells) (inverted phase contrast microscope, ×200); B: 7-day cultured DC: irregular cell morphology can be seen protruding cell body, large increase in cytoplasmic granules (Inverted phase contrast microscope, ×400); C: S-100 protein immunostaining, showing the first seven days of the DC cultured cells stained positive brown particles (Optical microscope, ×400); D: Electron micrograph of DC: cells have many different lengths protruding nucleus rather than the rules of chromatin rich in cytoplasm, more mitochondria (TEM, ×8 000).

2.1 DC形態(tài)觀察及表型鑒定結(jié)果 PBMC培養(yǎng)2 h后細(xì)胞呈貼壁生長（圖1A），在DC培養(yǎng)第24 h后，可見貼壁的單個(gè)核細(xì)胞形成較均勻散布的聚集體，有少量細(xì)胞呈半懸浮，細(xì)胞體積較小，多為圓形；至第4天，半懸浮細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞大量增殖聚集成團(tuán)，細(xì)胞體積較前增大，胞核呈不規(guī)則形態(tài)。少數(shù)細(xì)胞表面可見有毛刺狀突起；待加入TNF-α與肺癌TSA、超抗原SEA后，于培養(yǎng)6天-7天，細(xì)胞數(shù)目增多體積增大，細(xì)胞逐漸從聚集變?yōu)榉稚腋顟B(tài)，用相差顯微鏡可看到細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，可呈星狀、樹突狀，細(xì)胞表面從飽滿、透亮變?yōu)榘档?、邊緣模糊，?xì)胞表面大量毛刺狀突起，呈現(xiàn)典型的DC形態(tài)（圖1B）。DC經(jīng)流式細(xì)胞儀分析鑒定結(jié)果顯示，用此方法誘導(dǎo)培養(yǎng)7天可獲得大量高表達(dá)CD1a（65.2%）、HLADR（73.7%）、CD80（61.5%）低表達(dá)CD14（9.2%）的成熟型DC。SABC法免疫組化染色觀察DC結(jié)果顯示：陰性對照組細(xì)胞無染色，實(shí)驗(yàn)組僅陽性細(xì)胞胞漿內(nèi)有彌漫分布的棕黃色顆粒，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，有伸展的突起（圖1C）。透射電鏡觀察DC結(jié)果顯示：DC有許多長短不一的蔓狀突起和褶皺，構(gòu)成DC不規(guī)則的外形。胞質(zhì)內(nèi)含有較多滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、糖原顆粒和線粒體，還可見空泡等，溶酶體及吞噬體少。細(xì)胞核常偏居一側(cè)，核大而不規(guī)則，染色質(zhì)豐富（圖1D）。

2.2 各組效應(yīng)細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果 在DC與T淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)即聯(lián)合修飾后的DC活化T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)CTL過程中發(fā)現(xiàn)：在混合培養(yǎng)48 h，DC刺激T細(xì)胞大量增殖；在混合培養(yǎng)第7天，T細(xì)胞圍繞DC聚集成簇，誘導(dǎo)出特異性CTL細(xì)胞并增殖。

2.3 各種效應(yīng)細(xì)胞對不同靶細(xì)胞的殺傷活性 用MTT法測得各種效應(yīng)細(xì)胞對不同靶細(xì)胞的殺傷率，結(jié)果見表1。由表可看出，經(jīng)肺癌TSA、超抗原SEA聯(lián)合修飾后的TSASEA-DCL組效應(yīng)細(xì)胞對靶細(xì)胞GLC-82的殺傷活性明顯高于未經(jīng)聯(lián)合抗原修飾的DCL組（P＜0.01）、未經(jīng)肺癌可溶性抗原TSA致敏的SEA-DCL組（P＜0.01）和未經(jīng)超抗原SEA修飾的TSA-DCL組（P＜0.05）； TSA-SEA-DCL對GLC-82的殺傷率明顯高于對人紅白血病細(xì)胞K562的殺傷率（P＜0.01），這說明TSA-SEA-DCL具有高效而特異性的殺傷作用；而SEA-DCL組和DCL組對不同靶細(xì)胞的殺傷率之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），說明未經(jīng)腫瘤抗原修飾的SEA-DCL和DCL無選擇性殺傷靶細(xì)胞的表現(xiàn)。

2.4 靶細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)的鏡下觀察 在TSA-SEA-DCL特異性殺傷靶細(xì)胞過程中，混合培養(yǎng)2 h，發(fā)現(xiàn)CTL很快靠近腫瘤細(xì)胞，并逐漸聚集在其周圍及表面，共育4 h-6 h可見腫瘤細(xì)胞體積縮小，胞膜皺縮，細(xì)胞間隙變窄，貼壁程度下降，由貼壁逐漸回縮脫壁變圓形，漂浮于培養(yǎng)基中，少量腫瘤細(xì)發(fā)生變性壞死。電鏡下可見與CTL共育4 h的GLC-82細(xì)胞出現(xiàn)胞質(zhì)凝縮，核糖體、線粒體等聚集，核染色質(zhì)濃縮、邊集成新月狀，核膜凹陷、被分割，繼之可見核固縮、核膜出芽、染色質(zhì)脫落，形成凋亡小體，細(xì)胞發(fā)生調(diào)亡（圖2）。共育12 h，死亡細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞形態(tài)多呈圓形或不規(guī)則形，有的似發(fā)芽狀，有的伸出偽足樣不規(guī)則突起，胞核明顯固縮，染色質(zhì)凝結(jié)成塊狀并邊集，有些瘤細(xì)胞腫脹出現(xiàn)空泡，胞核腫脹，胞膜破裂，部分瘤細(xì)胞已經(jīng)溶解，有些只剩下輪廓；小部分貼壁生長的細(xì)胞胞質(zhì)顆粒增多，形態(tài)不規(guī)則，伸展性欠佳。共育24 h可見大量溶解的細(xì)胞碎片。而對照組GLC-82細(xì)胞貼壁生長較良好，K562為圓形懸浮細(xì)胞，充分生長。

表 1 效應(yīng)細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷率比較（%）Tab 1 Effector cells killing of target cells compare to the rates (%)

3 討論

圖 2 與誘導(dǎo)的CTL共育4 h的GLC-82細(xì)胞：胞質(zhì)凝縮，核染色質(zhì)濃縮、邊集，核膜凹陷，細(xì)胞發(fā)生凋亡（透射電鏡，×4 000）Fig 2 GLC-82 cells cultivated together with the induced CTL for 4 h: cytoplasmic condensation, nuclear chromatin condensation and margination, nuclear membrane depression, the cell apoptosis (TEM,× 4 000)

樹突狀細(xì)胞是目前所知的體內(nèi)最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞，從分化程度和成熟狀態(tài)來說可分為成熟DC（mature DC, mDC）和未成熟DC（immature DC, imDC）[1]。未成熟的DC存在于全身非淋巴組織中，具有很強(qiáng)的攝取處理抗原的能力，一旦發(fā)育為成熟的DC,捕獲抗原的能力即喪失，成為能激活靜息T細(xì)胞產(chǎn)生初次免疫應(yīng)答的抗原遞呈細(xì)胞。細(xì)胞因子是調(diào)節(jié)DC分化成熟的重要因素，不同細(xì)胞因子對DC的分化成熟存在不同影響。研究[2,3]發(fā)現(xiàn)，在DC培養(yǎng)基中加入GM-CSF、IL-4，僅可誘導(dǎo)出iDC，這類DC能通過吞噬、吞飲作用或受體介導(dǎo)有效地?cái)z取抗原，但刺激初始型T細(xì)胞的能力很弱，若給以一定的刺激信號如TNF-α、LPS、IL-1β、CD40L、腫瘤抗原、單核細(xì)胞條件培養(yǎng)基等，這些不成熟DC則進(jìn)一步分化成熟，具備較強(qiáng)的抗原提呈能力及刺激初始型T細(xì)胞增殖的功能。有實(shí)驗(yàn)[4]證實(shí)，TNF-α等雖可以促使DC分化成熟，但其可顯著下調(diào)DC胞吞能力及可溶性抗原攝取能力。故在DC負(fù)載抗原之前應(yīng)用TNF-α不利于DC攝取抗原。本研究在借鑒前人培養(yǎng)DC的基礎(chǔ)上，從外周血中獲取PBMC，經(jīng)貼壁培養(yǎng)得到粘附的單核細(xì)胞，再加GM-CSF和IL-4誘生出大量DC，在相差顯微鏡和電子顯微鏡下具有典型DC特征，較高地表達(dá)DC比較特征性的分子標(biāo)志CD1a和蛋白S-100，高表達(dá)MHC-II類分子HLA-DR及部分表達(dá)共刺激分子CD80等，而單核細(xì)胞表面標(biāo)志CD14+的表達(dá)則隨培養(yǎng)時(shí)間延長逐漸降低。有實(shí)驗(yàn)表明，DC在攝取抗原之后48 h內(nèi)如果未遇到炎性因子或細(xì)胞因子的刺激，抗原就會在細(xì)胞內(nèi)徹底降解，從而無法呈遞于細(xì)胞表面，而且如果僅僅應(yīng)用未成熟DC往往只能導(dǎo)致機(jī)體的免疫耐受，說明體外應(yīng)用有效的促成熟因子至關(guān)重要。實(shí)驗(yàn)于DC負(fù)載抗原（DC培養(yǎng)的第4天）后24 h（即DC培養(yǎng)的第5天）加入具有促成熟及維持DC生長作用的促成熟因子TNF-α，有效地使DC上調(diào)表達(dá)協(xié)同刺激分子CD80，表達(dá)高水平多肽-MHC復(fù)合物，且能分泌IL-12等，具有強(qiáng)烈激發(fā)初始型T細(xì)胞增殖的能力，呈現(xiàn)成熟DC的特點(diǎn)。DC攝取抗原并將其處理成具有免疫原性的多肽，以MHC——抗原肽復(fù)合物的形式表達(dá)于其表面的同時(shí)，其膜表面的協(xié)同刺激分子與T細(xì)胞表面相應(yīng)配體結(jié)合，進(jìn)而激活抗原特異性T細(xì)胞，促其活化增殖，產(chǎn)生免疫應(yīng)答[5]。

超抗原是高效的T細(xì)胞絲裂原，具有刺激T細(xì)胞增殖、增強(qiáng)免疫功能等生物學(xué)活性，它以完整的蛋白質(zhì)分子形式直接與抗原呈遞細(xì)胞膜的MHC-II類分子抗原結(jié)合槽結(jié)合并且提呈給T細(xì)胞[6]。超抗原主要是通過以下2種途徑發(fā)揮其對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。①SAg依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用：SAg激活的CD8+的殺傷力很強(qiáng)的抑制T細(xì)胞或CTL和CD4+的輔助性T細(xì)胞，直接或間接地殺傷表達(dá)有MHC-II類分子的腫瘤細(xì)胞；②細(xì)胞因子參與的抑瘤作用：被激活的T細(xì)胞可釋放多種細(xì)胞因子，非特異性地直接或間接殺傷腫瘤細(xì)胞，這些細(xì)胞因子主要包括腫瘤 TNF-α、IL-2、IFN-γ等[7]。

單純的抗原不能活化T淋巴細(xì)胞，必須經(jīng)過APC遞呈，因?yàn)門淋巴細(xì)胞活化需要抗原和輔助分子雙信號才能有效地誘導(dǎo)CTL形成，發(fā)揮抗瘤效應(yīng)。而腫瘤細(xì)胞可通過下調(diào)腫瘤相關(guān)抗原、低表達(dá)或不表達(dá)MHC分子和共刺激分子，使抗原不能被有效遞呈給T細(xì)胞以產(chǎn)生特異性的抗瘤效應(yīng)，因此激發(fā)有效的T細(xì)胞介導(dǎo)的抗瘤免疫反應(yīng)是提高腫瘤免疫治療效果的關(guān)鍵。負(fù)載腫瘤抗原的DC疫苗由于可通過DC表面MHC類分子、共刺激分子將各種已知或未知的腫瘤相關(guān)抗原信息得到有效遞呈，因此作為理想的腫瘤疫苗在實(shí)驗(yàn)和臨床研究受到廣泛重視[8,9]。肺癌細(xì)胞蛋白提取物中的腫瘤可溶性抗原刺激DC可能有多種不同的腫瘤特異抗原刺激DC，從而誘導(dǎo)針對不同抗原決定簇的CTL克隆等[10]。我們采用功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞即DC作為瘤苗載體，以肺癌TSA及超抗原SEA體外沖擊致敏DC并誘導(dǎo)活化T淋巴細(xì)胞，可以保證腫瘤抗原被有效攝取提呈，且可提供所需的共刺激信號，激發(fā)效應(yīng)細(xì)胞大量增殖，誘導(dǎo)產(chǎn)生了相對高效且特異的抗癌免疫效應(yīng)。