制備兩種p53重組腺病毒和流式細(xì)胞儀定量外源綠熒光蛋白表達(dá)

汪惠 賴百塘 李偉英 楊學(xué)惠 張春燕 韋攀健 李金照

我們?cè)隗w外研究中發(fā)現(xiàn)去除C-末端負(fù)調(diào)控區(qū)的p53比全長(zhǎng)p53在體外抑制人肺癌細(xì)胞的增殖作用更強(qiáng)[1]。為了進(jìn)一步深人研究去除p53 C-末端的生物學(xué)意義，該研究采用5型缺陷型腺病毒pAdEasy-Track載體系統(tǒng)[2]，構(gòu)建和制備了去C-末端p53和全長(zhǎng)p53重組腺病毒，命名為Adp53(del)和Ad-p53(wtp)。質(zhì)粒Track上有2個(gè)CMV啟動(dòng)子，可分別啟動(dòng)下游綠熒光蛋白（green fluorescence protein,GFP）基因和重組基因表達(dá)。GFP在細(xì)胞中表達(dá)可作為病毒感染和轉(zhuǎn)導(dǎo)外源基因效果的標(biāo)記。通常，用熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞GFP表達(dá)，但方法不夠準(zhǔn)確。該研究用流式細(xì)胞儀散點(diǎn)圖（flow cytometry scatter plot, FCM）可量化表達(dá)GFP細(xì)胞的百分率，為確定該病毒試驗(yàn)系統(tǒng)的可靠性和病毒感染人肺癌細(xì)胞濃度提供準(zhǔn)確方法。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系 人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞系801D，由中國(guó)人民解放軍301醫(yī)院提供。

1.2 缺陷型重組腺病毒的制備 按Tong-Chuan He[2]報(bào)告pAdEasy-Track載體系統(tǒng)和方法構(gòu)建。

1.2.1 構(gòu)建兩種類型p53重組質(zhì)粒Track-p53(del)和Trackp53(wtp) pAdEasy-N1（5型缺陷型腺病毒骨架）和Track由北京腫瘤研究所張志謙教授提供。用BamH1酶切重組質(zhì)粒pEGFP-N1-p53(del) cDNA和PEGFP-N1-p53(wtp)cDNA獲去C-末端p53和全長(zhǎng)p53片段。經(jīng)質(zhì)粒Track多克隆位點(diǎn)BigII（BamH1同位酶）插入構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染大腸菌E.coli，卡那霉素篩選耐受菌落。提DNA經(jīng)Awlnl和Hindi雙酶切重組質(zhì)粒，酶切圖篩選。

1.2.2 在細(xì)菌中產(chǎn)生同源重組體 pAdT-Ep53(del)、pAdT-Ep53(wtp)、pAdT-E。用酶pac1消化Track、Trackp53(del)、Track-p53(wtp)成線性，分別與pac1消化的pAdEasy-N1混合，用電轉(zhuǎn)移方法轉(zhuǎn)染大腸感受態(tài)桿菌（E.coli BJ5183株），Track和pAdEasy-N1在細(xì)菌中同源重組，kanamycin篩選耐受菌，挑選瓊脂培養(yǎng)基上的集落擴(kuò)增，提取DNA，經(jīng)瓊脂電泳分析DNA，選擇超螺旋構(gòu)象重組體，并進(jìn)一步用pac1酶切圖證明。經(jīng)Xho1、EcoR1酶切圖篩選三種重組體。

1.2.3 在293包裝細(xì)胞中制備缺陷型重組腺病毒 Adp53(del)、Ad-p53(wtp)、Ad-(empty carrier)。接種293細(xì)胞（1.5×105/3 cm平皿），lipofectamin分別轉(zhuǎn)染三種同源重組體，熒光顯微鏡監(jiān)測(cè)細(xì)胞中GFP表達(dá)。7 d-10 d收集細(xì)胞和上清，凍存，制備缺陷型腺病毒。

1.2.4 重組質(zhì)粒、同源重組體、重組腺病毒DNA測(cè)序重組質(zhì)粒：Track-p53(wtp)、Track-p53(del)，同源重組體：AdT-Ep53(del)、pAdT-Ep53(wtp)、pAdT-E，重組腺病毒；Ad-p53(del)、Ad-p53(wtp)、Ad-(empty carrier)提DNA由上海生工測(cè)序，經(jīng)Gene Bank公共數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)（blast）。

1.2.5 病毒濃度（multiplicity of infection）測(cè)定[2]接種293包裝細(xì)胞（5×106/3 cm/平皿），取病毒原液稀釋10倍后分別取0.75 μL、1.5 μL、3 μL、6 μL、12.5 μL、25 μL感染細(xì)胞，3 d后，F(xiàn)CM檢測(cè)801D細(xì)胞GFP表達(dá)。按下列公式計(jì)算每微升原液病毒的數(shù)量。

病毒原液最小體積是指上述稀釋病毒液感染細(xì)胞平皿中90%以上293細(xì)胞表達(dá)GFP所加入最少的病毒體積。接種293細(xì)胞數(shù)×10是指接種的細(xì)胞中每個(gè)細(xì)胞約含有10倍病毒。

1.2.6 病毒感染人肺癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)表達(dá) 接種2×106801D細(xì)胞，分別用于細(xì)胞50倍的三種重組腺病毒感染細(xì)胞接種裸鼠皮下，24 h后，取接種部位細(xì)胞團(tuán)壓片，于熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞GFP。

1.3 熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)體外感染細(xì)胞GFP表達(dá)

1.3.1 病毒感染801D細(xì)胞：制備 3×105801D細(xì)胞懸液，稀釋10倍后，分別用細(xì)胞的25、50、100、200倍3種病毒感染細(xì)胞，3 h后接種于平皿（3 cm）。37oC、CO2暖箱培養(yǎng)24 h。行熒光顯微鏡檢測(cè)，同時(shí)消化，洗滌，稀釋細(xì)胞，行FCM檢測(cè)細(xì)胞。

1.3.2 熒光顯微鏡（激發(fā)光為488 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為507 nm濾光片）檢測(cè)細(xì)胞GFP表達(dá)。

1.3.3 FCM scatter plot（激發(fā)光為488 nm）檢測(cè)細(xì)胞GFP表達(dá)。R6為無(wú)GFP表達(dá)細(xì)胞比率，R2、R3、R4、R5為表達(dá)GFP細(xì)胞和不同GFP熒光強(qiáng)度細(xì)胞的百分率（從弱到強(qiáng)）。

2 結(jié)果

2.1 去除C未端p53和全長(zhǎng)p53重組質(zhì)粒的構(gòu)建 構(gòu)建去C-末端p53和全長(zhǎng)p53重組質(zhì)粒Track-p53(del)和Trackp53(wtp)，經(jīng)Awlnl和Hind酶切圖篩選。

2.2 重組質(zhì)粒與pAdEasy-N1在細(xì)菌中產(chǎn)生同源重組體DNA瓊脂電泳構(gòu)像不同，選擇重組體（圖1）。由于Track上有兩個(gè)pac1酶切點(diǎn)，Easy上有一個(gè)酶切點(diǎn)，用pac1酶切重組體，可產(chǎn)生一個(gè)30 kb大片段和約3 kb-4 kb小片段（圖2）。經(jīng)Xho1、EcoR1酶切圖篩選Track-Eazyp53(del)、Track-Easy-p53(wtp)和Track-Easy（圖3）。

2.3 三種重組腺病毒制備 在L293細(xì)胞中制備了三種重組腺病毒：Ad-(empty carrier)、Ad-p53(del)和 Adp53(wtp)?？梢娂?xì)胞中GFP表達(dá)（圖4）。

2.4 測(cè)序結(jié)果（圖5） 兩種重組質(zhì)粒測(cè)序，經(jīng)Gene Bank公共數(shù)據(jù)庫(kù)blast證明Track-p53(wtp)無(wú)堿基缺失（圖5A）。Track-p53(del)在p53終止密碼子TGA前有111個(gè)堿基缺失和終止密碼子后的所有非編碼序列缺失（圖5B）。三種同源重組體（圖5C、D、E）和三種p53重組腺病毒（圖5F、G、H）測(cè)序結(jié)果經(jīng)blast證明p53序列與重組質(zhì)粒Track-p53(del)和Track-p53(wtp)結(jié)果相同。Track-Easy、Ad-(empty carrier)無(wú)p53序列。

2.5 病毒濃度 FCM scatter plot顯示90%以上L293細(xì)胞表達(dá)GFP，最小病毒感染細(xì)胞濃度：Ad-(empty carrier)、Adp53(wtp)為1.5 μL和Ad-p53(del)為3 μL（表1）。按上述M0i公式計(jì)算A、C病毒濃度為3.7×1010/mL，B病毒為1.6×1010/mL。

2.6 三種重組腺病毒感染人肺癌801D細(xì)胞GFP表達(dá)結(jié)果

2.6.1 病毒感染的801D細(xì)胞接種裸鼠體內(nèi)24 h后細(xì)胞GFP開始表達(dá)（圖6）。

2.6.2 熒光顯微鏡下觀察801D GFP表達(dá) 25、50、100、200倍三種病毒感染的801D細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞GFP表達(dá)（圖7）。對(duì)照細(xì)胞（無(wú)感染病毒的801D）無(wú)GFP表達(dá)。感染的801D細(xì)胞隨病毒濃度增加，表達(dá)GFP細(xì)胞的數(shù)量增加。細(xì)胞中有不同熒光強(qiáng)度細(xì)胞，隨病毒濃度增加，細(xì)胞熒光強(qiáng)度增加。同一濃度不同種類病毒GFP表達(dá)結(jié)果相近。但不能準(zhǔn)確估計(jì)各病毒濃度對(duì)細(xì)胞的感染率。

2.6.3 FCM scatter plot檢測(cè)結(jié)果 結(jié)果顯示對(duì)照細(xì)胞（無(wú)感染病毒的801D）99.9%無(wú)GFP表達(dá)（R6）（圖8D）。三種病毒感染的細(xì)胞均表達(dá)GFP（R2-R5）（圖8A、B、C；表2）。隨病毒濃度增加，細(xì)胞GFP表達(dá)率增加。Ad-p53(wtp)病毒感染（圖8A）：25倍有47%細(xì)胞表達(dá)GFP。50倍有68%。100倍有79%。200倍有95%。Adp53(del)病毒（圖8B）：25倍有37%細(xì)胞表達(dá)GFP，50倍有71%，100倍有74%，200倍為90%。Ad-(empty carrier)病毒感染801D（圖8C）：25倍感染有46%細(xì)胞表達(dá)GFP，50倍有62%，100倍有79%，200倍有94%。同一濃度不同病毒感染細(xì)胞表達(dá)GFP細(xì)胞的比率相近。此外，F(xiàn)CM scatter plot還顯示了三種病毒感染的801D細(xì)胞群體中包含了表達(dá)不同熒光強(qiáng)度（R2、R3、R4、R5）細(xì)胞的百分率（表3，圖9）。表達(dá)低熒光強(qiáng)度（R2）細(xì)胞約占9%，不隨病毒濃度增加，主要分布在低濃度感染的細(xì)胞。表達(dá)中等熒光強(qiáng)度（R3）的細(xì)胞比率最高，約占28%。細(xì)胞比率不隨病毒濃度增加而改變。高熒光強(qiáng)度（R4、R5）細(xì)胞分別約占20%、13%，主要分布在高濃度病毒（100倍、200倍）感染的細(xì)胞。提示801D由表達(dá)不同GFP強(qiáng)度的細(xì)胞組成。

圖 1 不同集落DNA在瓊脂電泳上構(gòu)象選擇同源重組體。5號(hào)為超螺旋同源重組體。Fig 1 DNA conformation of different clone on agarose gel electroporator to select homologous recombinants. The number 5 is homologous recombinant of supercoiled form.

圖 2 Pac1酶切圖證明重組體Fig 2 Pac1 restrictive endonuclease map of two p53 recombinants.1: Track; 2: Easy; 3: T-E-p53(wtp); 4: 5.T-E-p53(del); 6: marker(λ-HindIII).

圖 3 Xho1、HindIII酶切圖證明兩種重組p53Fig 3 Xho1, HindIII restrictive endonuclease map of two p53 recombinants. 1: T-Ep53(wtp); 2: T-Ep53(del); 3, 4: T-E; 5: Marker(λ-HindIII).

圖 4 L293細(xì)胞系中產(chǎn)生重組腺病毒Fig 4 Generation of pAdEasy-p53(del) in L293 cell line

表 1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)L293細(xì)胞GFP表達(dá)Tab 1 Detection GFP expression on L293 cells by FCM

3 討論

圖 6 轉(zhuǎn)染Ad-p53(del)病毒的細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)表達(dá)GFPFig 6 GFP expression of cells infected by Ad-p53(del) in vivo

圖 7 熒光顯微鏡檢測(cè)不同濃度Ad-p53(del)病毒感染 801D細(xì)胞GFP表達(dá)。50x（A），100x（B），200x（C）：轉(zhuǎn)染細(xì)胞的病毒濃度。Fig 7 Detection GFP expression by fluorescent microscopy in 801D cells infected with different density Ad-p53(del). 50x (A), 100x (B), 200x (C):different virus density to infect cells.

表 2 流式散點(diǎn)圖檢測(cè)不同病毒感染801D細(xì)胞表達(dá)GFP百分率Tab 2 Detection of percentage of 801D cell GFP-expressed by FCM scatter plot

表 3 流式散點(diǎn)圖顯示表達(dá)不同熒光強(qiáng)度細(xì)胞分布Tab 3 FCM scatter plot detection of distribution of fluorescent intensity in 801D cells infected with different viruses

圖 8 FCM scatter plot檢測(cè)801D細(xì)胞GFP表達(dá)。A：Ad-p53(wtp)轉(zhuǎn)染801D細(xì)胞GFP表達(dá)；B：Ad-p53(del)轉(zhuǎn)染801D細(xì)胞GFP表達(dá)；C：Ad-(empty carrier)轉(zhuǎn)染801D細(xì)胞GFP表達(dá)；D：無(wú)轉(zhuǎn)染801D。Fig 8 Detection GFP expression in cells infected-viruses by FCM scatter plot. A: GFP expression in cells infected-Ad-p53(wtp); B: GFP expression in cells infected-Ad-p53(del); C: GFP expression in cells infected-Ad-(empty carrier); D: Without GFP expression in control 801D cells.

圖 9 流式顯示表達(dá)不同熒光強(qiáng)度細(xì)胞的分布Fig 9 FCM scatter plot indicate GFP distribution to cells infected by Adp53(wtp) (A), Ad-p53(del) (B) and Ad-(empty carrier) (C)

抑癌基因p53作為轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞應(yīng)激時(shí)呈活化狀態(tài)，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖周期和細(xì)胞程序性死亡抑制腫瘤生長(zhǎng)，通常處于非活化型，通過(guò)各種機(jī)制包括p53 C-末端負(fù)調(diào)控區(qū)的作用所致[3-5]。先前，我們利用轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在體外試驗(yàn)中已證明了外源去C-末端p53比全長(zhǎng)p53抑制人肺癌細(xì)胞801D的增殖作用更強(qiáng)。并發(fā)現(xiàn)可增加對(duì)抗腫瘤藥物敏感性（尚未發(fā)表）。重組腺病毒是研究外源基因表達(dá)及生物學(xué)功能和基因治療的重要載體[6]。該文報(bào)告了采用pAdEasy-Track載體系統(tǒng)構(gòu)建和制備了去C-末端p53和全長(zhǎng)p53兩種重組腺病毒Ad-p53(del)、Ad-p53(wtp)以及空載體Ad-(empty carrier)。該載體系統(tǒng)可快速大量產(chǎn)生重組腺病毒為進(jìn)一步深人研究p53 C-末端負(fù)調(diào)節(jié)功能提供了條件。病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)外源基因的效果是進(jìn)行研究的必要前提。由于病毒、細(xì)胞、感染方法和實(shí)驗(yàn)條件等諸多因素可影響到病毒載體對(duì)細(xì)胞感染和轉(zhuǎn)基因效果，因此建立精確檢測(cè)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因效果的方法用于估價(jià)所建立的病毒試驗(yàn)系統(tǒng)的可靠性和準(zhǔn)確性是重要的。通常，通過(guò)重組質(zhì)粒上的標(biāo)記基因表達(dá)作為病毒感染細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因的標(biāo)記。該研究所用質(zhì)粒Ad Track上有2個(gè)CMV啟動(dòng)子，分別起動(dòng)GFP標(biāo)記基因和外源基因表達(dá)。通常用熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞GFP表達(dá)，但結(jié)果不夠精確。用FCM檢測(cè)可精確顯示GFP表達(dá)[7,8]。本研究采用FCM檢測(cè)L293細(xì)胞GFP表達(dá)可精確確定重組腺病毒的濃度。在分別用25、50、100、200倍重組腺病毒感染人肺癌801D細(xì)胞后，用熒光顯微鏡和FCM兩種方法檢測(cè)細(xì)胞。結(jié)果顯示熒光顯微鏡觀測(cè)可見表達(dá)GFP細(xì)胞隨病毒濃度遞增，三種病毒感染細(xì)胞表達(dá)GFP效果比較接近。并可見表達(dá)GFP細(xì)胞群體中包含了表達(dá)不同熒光強(qiáng)度的細(xì)胞。但不能準(zhǔn)確估計(jì)表達(dá)GFP細(xì)胞比率。FCM scatter plot能夠準(zhǔn)確顯示感染細(xì)胞GFP表達(dá)百分率。隨病毒濃度遞增。不同病毒相同濃度感染，細(xì)胞GFP表達(dá)百分率接近。結(jié)果為選擇病毒感染細(xì)胞的合適濃度做了提示。此外，scatter plot顯示801D細(xì)胞群體中包含了4種不同熒光強(qiáng)度比率的細(xì)胞。表達(dá)低熒光強(qiáng)度（R2）細(xì)胞約占9%，不隨病毒濃度增加。表達(dá)中等熒光強(qiáng)度（R3）的細(xì)胞比率最高，約占28%，病毒濃度增加，細(xì)胞比率無(wú)明顯改變。高熒光強(qiáng)度（R4、R5）細(xì)胞分別約占20%、13%，主要分布在高濃度病毒（100倍、200倍）感染的細(xì)胞。探其緣由可能與腫瘤細(xì)胞表面的病毒特異性科薩奇腺病毒受體（coxsackie and adenovirus receptor,CAR）以及整合素（integrin）的表達(dá)水平不同有關(guān)。在腺病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞的感染和轉(zhuǎn)導(dǎo)外源基因表達(dá)中它們起著決定性作用[9]。801D存在表達(dá)特異性表面受體和整合素水平不同的細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性的表現(xiàn)[10]。該結(jié)果提示針對(duì)不同腫瘤患者采用不同濃度的重組腺病毒進(jìn)行基因治療可能更有利于患者治療?？傊現(xiàn)CM scatter plot檢測(cè)所顯示的優(yōu)點(diǎn)是重組腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)外源基因生物學(xué)實(shí)驗(yàn)和重組腺病毒為載體的臨床基因治療中值得推崇的方法。

本研究采用pAdEasy-Track載體系統(tǒng)成功構(gòu)建和制備了去C-末端p53和全長(zhǎng)p53兩種重組腺病毒：Adp53(del)、Ad-p53(wtp)以及空載體Ad-(empty carrier)。FCM scatter plot定量顯示感染細(xì)胞中表達(dá)外源GFP細(xì)胞百分率和表達(dá)不同熒光強(qiáng)度細(xì)胞的百分率，證明了該病毒試驗(yàn)系統(tǒng)可靠性和為選擇病毒感染人肺癌細(xì)胞801D的合適濃度提供準(zhǔn)確方法。