姜黃素對人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞抑制作用的研究

藍(lán)育青 鄭海生 張弛 周懷勝 郭慧

青光眼已成為世界范圍內(nèi)占第二位的不可逆性致盲眼病，而濾過手術(shù)是治療青光眼的重要手段之一，其方法是通過被切除的小梁組織形成一濾過通道，使房水外流從而達(dá)到降低眼壓，保存殘存視功能的目的。但濾過手術(shù)存在10%～30%的失敗率［1］，其失敗的直接原因主要是濾過口處成纖維細(xì)胞的增殖、遷移而導(dǎo)致濾過道的纖維瘢痕化，使濾過通道堵塞.這也是青光眼臨床與研究中所面臨的難題之一，術(shù)中應(yīng)用抗增殖藥物如絲裂霉素(mitomycin，MMC)經(jīng)術(shù)后的臨床觀察可提供手術(shù)的成功率，但也存在一定的毒副作用限制其使用。因此許多眼科工作者為防治濾過手術(shù)的失敗而尋找安全、有效抑制成纖維細(xì)胞增殖的方法進(jìn)行著不懈的努力。姜黃素是一種歷史悠久的傳統(tǒng)中藥，具有多種療效:抗纖維增殖作用［2］、抑制血管生成［3］、抗腫瘤作用［4］、抗氧化作用［5］、抗炎作用等多種藥理作用，且無明顯毒副作用具有較好的臨床應(yīng)用前景。目前其在對其他器官和組織的成纖維細(xì)胞方面的研究和應(yīng)用中取得了一定的成果和進(jìn)展，但在研究姜黃素對人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞中的作用還比較少，為研究姜黃素對體外培養(yǎng)的人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞的抗增殖的作用效果，從而探索防治青光眼手術(shù)區(qū)濾過泡纖維瘢痕化的新途徑，提高青光眼手術(shù)成功率。筆者設(shè)計(jì)以下實(shí)驗(yàn)。

1 材料和方法

1.1 材料與主要儀器設(shè)備

1.1.1 試劑 CCK-8(Cell Counting Kit-8)(Dojindo公司)、姜黃素(購自SIGMA公司)、vimentin單克隆抗體(博士德公司)、DAB顯色試劑(博士德公司)。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 CO2培養(yǎng)箱(德國Heraeus BB16)、手術(shù)顯微鏡(德國 Zeiss)、光學(xué)倒置顯微鏡(德國 Leica MPS-30)、Wellscan MK3酶標(biāo)儀(美國 Labsystem Dragon)、

1.2 方法

1.2.1 人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定 眼球結(jié)膜下Tenon囊組織標(biāo)本為中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院眼科青光眼手術(shù)切除組織，采用組織塊培養(yǎng)法原代接，第3～6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。按常規(guī)方法培養(yǎng)細(xì)胞［6］，并活體顯微鏡、組織學(xué)觀察與進(jìn)行細(xì)胞照相。利用蓋玻片培養(yǎng)法進(jìn)行HE染色，并取第3代細(xì)胞按免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒說明書作Vimentin染色鑒定細(xì)胞。

1.2.2 CCK-8法檢測姜黃素對人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞的增殖的影響 實(shí)驗(yàn)方法、步驟:①取處于對數(shù)生長期的Tenon囊成纖維細(xì)胞以10%胎牛血清的高糖DMEM制備為2500個(gè)/ml細(xì)胞懸液，每孔加入100 μl的細(xì)胞懸液分別接種于4塊96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，貼壁;②至細(xì)胞長至單層后，分別在細(xì)胞中加入終濃度為 10、20、40、80 μg/ml的姜黃素，同時(shí)設(shè)不加藥的陰性對照和只加培養(yǎng)液的空白對照，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔;③再將96孔培養(yǎng)板分別培養(yǎng)24、48、72、96 h后，向每孔中加入10%胎牛血清的高糖 DMEM培養(yǎng)基100 μl及10 μlCCK-8繼續(xù)放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 h;④酶標(biāo)儀檢測450 nm處各孔OD值;每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 細(xì)胞增生抑制率的計(jì)算 根據(jù)CCK-8的吸光度(A)值計(jì)算出細(xì)胞增生抑制率并繪制時(shí)間、劑量效應(yīng)曲線。增生抑制率%=(對照組 A值-實(shí)驗(yàn)組 A值)/對照組 A值×100%

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)用SPSS 11.0軟件包處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)計(jì)量資料用(±s)表示，CCK-8對人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞抑制率的濃度和時(shí)間關(guān)系采用多組定量資料的單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)及生物特性鑒定

2.1.1 體外培養(yǎng)人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞的形態(tài)特征和生物特性 倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞，可見原代培養(yǎng)的組織塊約一周后細(xì)胞開始從組織塊周邊游離出來(圖1A)，胞體狹長，透亮，胞漿豐富，核圓形、橢圓形。胞膜清晰，呈典型的梭形，繁殖較快，約2～3周細(xì)胞增殖基本融合，細(xì)胞變長，靠近，呈放射狀或漩渦狀走行(圖1B)。

圖1 人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞原代與傳代培養(yǎng)A.原代培養(yǎng)的組織塊約6～7 d后細(xì)胞開始從組織塊周邊游離出來B.成纖維細(xì)胞胞膜清晰，呈典型的梭形，呈放射狀或漩渦狀走行

2.1.2 人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞組織學(xué)觀察HE染色及免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定 細(xì)胞經(jīng)HE染色，可見細(xì)胞呈兩頭尖的長梭型，不規(guī)則。胞核較大，色淺藍(lán)，位于細(xì)胞中央;細(xì)胞胞漿豐富，色淡紅，細(xì)胞膜清晰(圖2A)。細(xì)胞經(jīng)免疫化學(xué)Vimentin染色，可見陽性產(chǎn)物呈棕色，均勻分布于細(xì)胞的胞漿中(圖2B)。根據(jù)組織的取材部位、細(xì)胞的形態(tài)并結(jié)合免疫細(xì)胞化學(xué)的鑒定可確定實(shí)驗(yàn)中所培養(yǎng)的細(xì)胞為人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞。

圖2 人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞HE染色與鑒定A HE染色，呈長梭型，胞核較大，色淺藍(lán)，位于細(xì)胞中央;胞漿豐富，色淡紅 B經(jīng)Vimentin染色，陽性產(chǎn)物呈棕色，均勻分布于細(xì)胞的胞漿中

2.2 CCK-8法檢測姜黃素對人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞增殖的影響 CCK-8法檢測姜黃素對人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞增殖的影響結(jié)果見表1，并根據(jù)不同濃度姜黃素組在不同時(shí)間里對細(xì)胞的抑制率繪制時(shí)間、劑量效應(yīng)曲線(圖3)。

圖3 不同濃度姜黃素組在不同時(shí)間里對人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞的抑制率變化

表1 姜黃素對Tenon囊成纖維細(xì)胞增生的影響(±s)

表1 姜黃素對Tenon囊成纖維細(xì)胞增生的影響(±s)

注:單因素方差分析表明各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，﹡P＜0.01;與臨近濃度組比較，△P＜0.01;與臨近時(shí)間組比較，★P＜0.05

姜黃素濃度(μg/m l)值 生長抑制率0 0.552±0.010 0.660±0.008 1.188±0.032 1.535 24 h 48 h 72 h 96 h OD值 生長抑制率 OD值 生長抑制率 OD值 生長抑制率 OD 97.7±0.023 10 0.498±0.008﹡ 9.8 0.533±0.014﹡★ 19.2 0.602±0.020﹡★ 49.3 0.660±0.009﹡★ 57.0 20 0.430±0.004﹡△ 22.1 0.436±0.016﹡△★ 33.9 0.499±0.011﹡△★ 58.0 0.569±0.012﹡△★ 62.9 40 0.389±0.005﹡△ 29.5 0.385±0.007﹡△★ 41.7 0.212±0.005﹡△★ 82.2 0.078±0.003﹡△★ 94.9 80 0.319±0.011﹡△ 42.2 0.321±0.013﹡△★ 51.4 0.093±0.004﹡△★ 92.2 0.036±0.006﹡△★

即姜黃素濃度≥10 μg/ml時(shí)，能抑制人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞的增殖(P＜0.01)，并隨藥物濃度的升高、時(shí)間的延長，姜黃素對Tenon囊成纖維細(xì)胞的抑制強(qiáng)度逐漸加大(P＜0.01)。72 h以上姜黃素對細(xì)胞的生長抑制率基本穩(wěn)定。

3 討論

青光眼是僅次于白內(nèi)障的導(dǎo)致視力喪失的主要原因。據(jù)流行病學(xué)研究資料表明，全球原發(fā)性青光眼的患者約超過6680萬人，其中約10%失明，因此對青光眼的防治是防盲治盲公共衛(wèi)生工作的重點(diǎn)之一，具有重大的意義。目前，濾過手術(shù)是青光眼治療的重要手段之一，但有些患者術(shù)后卻因?yàn)V過道的纖維瘢痕化，使濾過通道堵塞而導(dǎo)致手術(shù)的失敗。通常濾過通道的瘢痕形成中一個(gè)主要的原因是:手術(shù)創(chuàng)傷刺激手術(shù)部位的Tennon囊下間隙使成纖維細(xì)胞增殖、移行、釋放膠原蛋白，引起纖維血管反應(yīng)和傷口的收縮，纖維瘢痕形成，導(dǎo)致濾過失?。?］。因此本課題為了探索防治青光眼手術(shù)區(qū)濾過泡纖維瘢痕化的新途徑，提高青光眼手術(shù)成功率，設(shè)計(jì)了此實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)直接從人眼Tenon囊組織中培養(yǎng)出成纖維細(xì)胞，其生物學(xué)特性符合人眼病變的情況。筆者通過姜黃素作用體外培養(yǎng)的人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞發(fā)現(xiàn):在0～80 μg/m l濃度作用24～96 h范圍內(nèi)，姜黃素可以抑制人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞的增長，且呈劑量和時(shí)間依賴性。姜黃是一種姜科姜黃屬的草本植物，具有多種療效。Elena等［8］研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠通過抑制蛋白激酶Cε(PKCε)的表達(dá)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的硬皮病肺成纖維細(xì)胞(scleroderma lung fibroblasts，SLF)發(fā)生凋亡。同樣高蔚等［9］在研究姜黃素對大鼠肺成纖維細(xì)胞(MLF)增殖和凋亡的影響中發(fā)現(xiàn)姜黃索對MLF有抑制作用，存在劑量依賴與時(shí)間依賴性。本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果基本上與上述研究發(fā)現(xiàn)一致，這說明姜黃素對不同組織中成纖維細(xì)胞增殖都有抑制作用。但姜黃素抑制人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞的分子機(jī)制仍不清楚。目前，國內(nèi)外在對姜黃素抑制各種腫瘤細(xì)胞或類腫瘤細(xì)胞作用機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)可能與對細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)及各種細(xì)胞生長因子的影響有關(guān)［10］。如可能與下調(diào)NF-kappaB，抑制 iNOS、COX-2 活性有關(guān)［11］。而姜黃素對人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞增殖的抑制是否同樣存在相似的機(jī)制，這也是下一步需要研究的問題。

在本實(shí)驗(yàn)中所用的Cell Counting Kit-8(CCK-8)法評價(jià)姜黃素對人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞的增殖影響是用于測定細(xì)胞增殖或毒性試驗(yàn)中活細(xì)胞數(shù)目的一種高靈敏度，無放射性的比色檢測法。其利用了四唑鹽-WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2，4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽)，它在電子載體1-Methoxy PMS存在的情況下能夠被還原成水溶性的甲臜染料。CCK-8溶液可以直接加入到細(xì)胞樣品中;不需要預(yù)配各種成分(比較MTT法減少了加DMSO的步驟，從而可進(jìn)一步減少實(shí)驗(yàn)中因操作引起的誤差)。WST-8被細(xì)胞內(nèi)脫氫酶生物還原后生成的橙色甲臜染料能夠溶解在組織培養(yǎng)基中，生成的甲臜量與活細(xì)胞數(shù)量成正比。與其他研究體外培養(yǎng)細(xì)胞中研究細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)方法相比，CCK-8法檢測細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的靈敏度比其他四唑鹽如MTT、XTT、MTS或WST-1高、誤差小，并且CCK-8溶液相當(dāng)穩(wěn)定，對細(xì)胞沒有毒性，因此可以長時(shí)間孵育。因此，CCK-8比色檢測法在檢測細(xì)胞增殖中正成為一種主流方法。

在本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了了姜黃素對體外培養(yǎng)的人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞具有抗增殖作用，為下一步進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供了研究基礎(chǔ)，同時(shí)對姜黃素防治青光眼手術(shù)區(qū)濾過泡纖維瘢痕化，提高青光眼手術(shù)成功率提供了理論依據(jù)。

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