嫁接辣椒根腐病抗性及其與苯丙烷類物質代謝的關系

姜 飛 劉業(yè)霞 劉 偉 鄭 楠 王洪濤 艾希珍*

（1山東農業(yè)大學園藝科學與工程學院，作物生物學國家重點實驗室，園藝作物生物學農業(yè)部重點開放實驗室，山東泰安 271018；2山東省棗莊市農業(yè)示范園區(qū)，山東棗莊 277300）

嫁接辣椒根腐病抗性及其與苯丙烷類物質代謝的關系

姜 飛1劉業(yè)霞1劉 偉1鄭 楠1王洪濤2艾希珍1*

（1山東農業(yè)大學園藝科學與工程學院，作物生物學國家重點實驗室，園藝作物生物學農業(yè)部重點開放實驗室，山東泰安 271018；2山東省棗莊市農業(yè)示范園區(qū)，山東棗莊 277300）

通過人工接種根腐病菌，觀察不同品種辣椒砧木的發(fā)病率和病情指數(shù)變化，發(fā)現(xiàn)衛(wèi)士發(fā)病晚，發(fā)病率低，病情指數(shù)最小，說明衛(wèi)士的抗病性最強。以衛(wèi)士為砧木，以赤峰特選甜椒（Capsicum annuum L.var.grossum Bailey）為接穗，自根辣椒為對照，研究嫁接對辣椒根腐病抗性及苯丙烷類代謝的影響，結果表明，嫁接植株的發(fā)病率和病情指數(shù)顯著低于對照，高于砧木。接種前砧木與嫁接辣椒根系中的可溶性糖、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性顯著高于對照，而葉片中的顯著低于對照；酚類物質和木質素含量與對照差別不大。接種后辣椒根系中的可溶性糖含量逐漸降低，PAL活性、酚類物質和木質素含量先逐漸升高，10d后趨于平穩(wěn)或有所下降。與對照相比，砧木和嫁接植株根系中的PAL活性、可溶性糖、酚類物質和木質素含量均顯著增加，葉片中除可溶性糖含量顯著降低外，其他指標也有不同程度的增加。說明嫁接可顯著提高辣椒的根腐病抗性，其抗病機理與苯丙烷類物質代謝增強密切相關。

辣椒；嫁接；根腐?。槐奖轭?；次生代謝

辣椒（Capsicum annuum L.）是設施栽培的主要蔬菜之一，由于生產種類單一和多年連作重茬，近年來設施中的生態(tài)環(huán)境逐漸惡化，連作障礙日趨嚴重，土傳病害逐年加重，成為限制其高產栽培和安全生產的重要障礙。辣椒根腐病是一種典型的土傳病害，一般年份發(fā)病率在10 %左右，嚴重時可達20 %～30 %，重病地塊高達50 %以上（劉麗云 等，2007），是近年來影響設施辣椒生產的重要病害之一。引起辣椒根腐病的病原菌有多種，如腐皮鐮孢菌〔Fusarium solani（Mart.）App. et Wollenw.〕（呂佩珂 等，1998）、大麗輪枝菌（Verticilliumdahliae Kleb.）（陸家云 等，1984）、疫霉菌（Phytophthora capsici Leonion）（van Steekelenburg，1980；朱輝 等，2007）等。筆者從山東棗莊采集的根腐病病株中分離到兩種病菌，并經DNA測序鑒定發(fā)現(xiàn)一種為常見的腐皮鐮孢菌，另一種為辣椒核盤菌〔Sclerotinia sclerotriorum（Lib）de Bary〕。由這些病原菌引起的根腐病癥狀相似，均表現(xiàn)為地上部萎蔫，根和莖基部腐爛，木質部變褐。

嫁接作為防止土傳病害、克服連作障礙的一項重要栽培措施，已被廣泛應用于黃瓜、西瓜、茄子、番茄等蔬菜作物上（周寶利 等，1998；何莉莉 等，2001；徐敬華 等，2004；張鳳麗 等，2005；馮春梅 等，2006；陳紹莉 等，2008；王紹輝 等，2008），而在辣椒中應用較少。近年來研究發(fā)現(xiàn)，根系發(fā)達的半野生類型辣椒砧木高抗根結線蟲病，且具有發(fā)芽快，嫁接成活率高等優(yōu)點，對克服辣椒連作障礙，提高抗逆性有良好的效果（Morra & Bilotto，2003；Santos &goto，2004）。本試驗對不同來源的4個辣椒砧木材料的根腐病抗性進行比較和鑒定，并利用抗病性強的砧木材料，研究嫁接辣椒體內莽草酸-苯丙烷類代謝途徑的前體可溶性糖、關鍵酶 PAL、中間產物酚類物質、終產物木質素等指標的變化特點，旨在探討嫁接辣椒根腐病抗性與莽草酸-苯丙烷類代謝的關系，為明確嫁接辣椒的抗病機理提供理論依據，也為減輕根腐病為害，增強設施辣椒的抗病性提供技術指導。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗設計

1.1.1 不同砧木品種對辣椒根腐病的抗性比較 試驗于2008～2009年在山東農業(yè)大學園藝試驗站進行。供試砧木品種為富根衛(wèi)士（簡稱衛(wèi)士，日本）、鐵木砧（荷蘭）、格拉夫特（國家蔬菜工程技術研究中心）、部野丁（壽光新世紀種苗有限公司），以甜椒（Capsicum annuum L. var.grossum Bailey）赤峰特選（內蒙古赤峰田園種藝有限公司）為對照。7月20日播種，基質經160℃高溫殺菌2 h，用54孔穴盤育苗，9月5日定植于20cm×20cm的塑料盆中，日光溫室條件下常規(guī)管理。9月28日將植株輕輕拔起，剪去部分根尖，將根系置于孢子濃度5×106個·mL-1的辣椒鐮孢菌〔Fusarium solani（Mart.）App. et Wollenw.〕（從棗莊市農業(yè)示范園區(qū)辣椒田中分離獲得）菌液中浸泡10min，然后重新栽到塑料盆中，每品種接種150株，分3次重復，每重復50株。

1.1.2 嫁接對辣椒根腐病抗性的影響 以抗病性最強的衛(wèi)士為砧木，以赤峰特選甜椒為接穗，分別于10月27日和11月7日播種，用54孔穴盤育苗，日光溫室條件下常規(guī)管理。砧木苗7～8葉時（12月7日）采用劈接法嫁接。為減小生長誤差，同時將接穗進行自根嫁接作為對照。30d后（1月6日）在砧木、嫁接和自根植株根系上分別接種辣椒鐮孢菌，方法同1.1.1。

1.2 測定項目

發(fā)病率與病情指數(shù)：砧木篩選分別于接種后7、14、21、30d調查發(fā)病率；參照李林等（2001）的方法分級，計算病情指數(shù)；嫁接植株抗病效果于接種后5、10、15、20d調查和測定。

可溶性糖含量采用李合生（2000）的蒽酮比色法測定；酚類物質含量按周寶利等（1998）的Folin試劑比色法測定；木質素含量按Sancho等（1996）的半定量法測定。

苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性參照李合生（2000）的方法，作以下修改：分別取0.5g功能葉和根，加入5mL提取液〔內含0.05g吡咯烷酮（PVP）、5mmol·L-1巰基乙醇和0.05mol·L-1硼酸緩沖液（pH8.8）〕，冰浴勻漿，4℃下10000×g離心20min，上清液為酶粗提液。取4mL反應液（內含0.02mmol·L-1的苯丙氨酸1mL，蒸餾水2mL和酶液1mL），用日本島津公司生產的UV-2450型分光光度計測定290 nm吸光度（A290），以A290每小時變化0.01所需酶量為一單位，用U·g-1表示。

1.3 數(shù)據處理

采用microsoft excel軟件處理數(shù)據和作圖，DPS軟件對數(shù)據進行單因素方差分析，并運用Duncan檢驗法對顯著性差異進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同砧木品種對辣椒根腐病的抗性比較

對不同品種辣椒砧木和對照的根腐病發(fā)病率和病情指數(shù)進行調查（表1），人工接種7d后，格拉夫特、鐵木砧和對照均已發(fā)病，衛(wèi)士和部野丁沒有發(fā)現(xiàn)病株。格拉夫特和鐵木砧的發(fā)病率與病情指數(shù)均與對照差異不顯著。14d后衛(wèi)士仍未發(fā)病，部野丁、格拉夫特、鐵木砧和對照的發(fā)病率分別達到30 %、35 %、45 %和40 %，病情指數(shù)為12.3、21.5、25.7和20.3，部野丁的病情指數(shù)顯著低于對照，格拉夫特和鐵木砧的病情指數(shù)與對照差異不顯著。接種21d和30d后分別調查，發(fā)現(xiàn)衛(wèi)士發(fā)病最輕，部野丁其次，格拉夫特和鐵木砧最重，衛(wèi)士和部野丁的病情指數(shù)顯著小于對照，而格拉夫特和鐵木砧與對照差異不顯著。表明衛(wèi)士對辣椒根腐病的抗性最強，在下一步試驗中選擇衛(wèi)士作砧木研究嫁接辣椒的抗病效果。

表1 辣椒不同砧木品種的根腐病發(fā)病率與病情指數(shù)

2.2 嫁接對辣椒根腐病發(fā)病率和病情指數(shù)的影響

本試驗所用植株較砧木篩選試驗的植株略小，因此從接種后5d開始調查砧木、嫁接和自根植株的發(fā)病率和病情指數(shù)，以后每隔5d調查1次。從表2看出，人工接種后，自根辣椒發(fā)病最早（5d），嫁接辣椒其次（10d），砧木最晚（15d）。接種20d后調查，砧木、嫁接和自根植株的發(fā)病率分別為22 %、42 %和66 %，病情指數(shù)為13.75、28.76和47.88，三者差異顯著。

表2 辣椒砧木、嫁接和自根植株根腐病發(fā)病率與病情指數(shù)

2.3 嫁接對辣椒可溶性糖含量的影響

圖1顯示，接種前砧木及嫁接辣椒根系中的可溶性糖含量顯著高于自根對照，而葉片中的顯著低于對照。接種根腐病菌后根系的可溶性糖含量逐漸降低，而葉片中的先增加后降低。砧木和嫁接植株根系的可溶性糖含量仍顯著高于對照，而葉片中的明顯低于對照?？梢姡抵懈咛呛渴钦枘竞图藿永苯分仓旮】剐栽鰪姷闹匾蛑?，感病可顯著降低辣椒植株的可溶性糖含量。

圖1 嫁接對辣椒根系和葉片可溶性糖含量的影響

2.4 嫁接對辣椒苯丙氨酸解氨酶活性的影響

接種前測定（圖2），砧木和嫁接植株根系中的 PAL活性顯著高于自根對照，而葉片中的明顯低于對照；接種根腐病菌后，砧木、嫁接和自根植株根系和葉片中的PAL活性均逐漸升高，10d后根系中的PAL活性快速降低，葉片中的趨于平穩(wěn)或略有下降。與對照相比，砧木、嫁接植株根系和葉片中的PAL活性有不同程度的升高。接種15d后測定，砧木和嫁接植株根系中的PAL活性分別比對照增加了30.1 %和3.2 %，葉片中的分別比對照增加了9.3 %和12.5 %，表明PAL活性與辣椒植株的根腐病抗性有一定相關性。

2.5 嫁接對辣椒酚類物質含量的影響

從圖3可以看出，接種前砧木、嫁接和對照根系中的酚類物質含量差異不顯著，接種后10d內均呈上升趨勢，但砧木和嫁接植株的上升幅度顯著大于自根對照；10d后砧木和嫁接植株趨于平穩(wěn)，對照略有下降。接種15d后測定，砧木和嫁接植株根系的酚類物質含量分別比對照高52.4 %和70.8 %。嫁接辣椒葉片中的酚類物質含量變化規(guī)律與根系相似，即接種后快速升高，10d后趨于平穩(wěn)；砧木葉片中的呈緩慢上升趨勢，但變化幅度很??；對照則緩慢下降。接種15d后砧木和嫁接植株葉片的酚類物質含量分別比對照高29.1 %和98.3 %。

圖2 嫁接對辣椒根系和葉片苯丙氨酸解氨酶活性的影響

2.6 嫁接對辣椒木質素含量的影響

圖4顯示，接種根腐病菌后砧木、嫁接和自根對照植株根系和葉片中的木質素含量都逐漸升高，根系表現(xiàn)尤其明顯。與對照相比，砧木和嫁接植株根系中的木質素含量顯著增加；葉片中的木質素含量開始時差異不大，10d后較明顯升高?？梢?，砧木和嫁接植株木質素的含量升高是其根腐病抗性增強的重要原因之一。

圖4 嫁接對辣椒根系和葉片木質素含量的影響

3 結論與討論

前人研究已經證明，嫁接可誘導植物抗病性（Lockwood et al.，1970；Yamakawa，1982；周寶利和姜荷，2001）。嫁接植株的抗病性可能一方面來自于砧木抗病物質的向上傳導，另一方面由于嫁接本身誘導刺激作用產生的（周寶利和姜荷，2001）。Zhang等（2008）研究結果表明，番茄砧木可調節(jié)茄子接穗的功能基因，如正常代謝基因、信號轉導基因、逆境響應基因等的表達。本試驗結果表明，利用根腐病抗性強的砧木嫁接辣椒，可顯著提高辣椒的抗病性，但與砧木相比，嫁接辣椒的發(fā)病率和病情指數(shù)明顯升高，說明砧木和接穗之間存在互作關系，即砧木增強了接穗的抗病性，而接穗削弱了砧木的抗病性。因此，嫁接植株的抗病性主要來自于砧木抗病物質的向上傳導。

接種根腐病菌后，砧木、嫁接和自根對照植株根系的可溶性糖含量逐漸降低，這一方面說明植株生長受抑制，物質積累減少，另一方面可能與糖是病菌的重要碳源有關；而葉片中的可溶性糖含量接種初期增加應歸因于滲透調節(jié)，即根系感病后，根系吸水功能減弱，為了維持正常的代謝功能，植株通過增加葉片中的可溶性糖等滲透調節(jié)物質，提高細胞液的濃度，減少葉片失水。接種前后砧木和嫁接植株根系中的可溶性糖含量顯著高于對照，而葉片中的顯著低于對照，說明砧木和嫁接植株通過改變糖在根系和葉片中的分配，提高根系的滲透調節(jié)能力，從而維持較強的吸收功能。因此，可溶性糖含量與根腐病抗性互為因果關系，即可溶性糖含量高，根系的滲透調節(jié)能力強，則抗性強；反之，根系抗病能力強，則發(fā)病輕，病菌對碳源的消耗少，可溶性糖含量升高。

酚類是植物重要的次生代謝產物，除本身對病菌有毒外，還與細菌壁相結合，促進細胞壁木質化、木栓化，因而具有植保素的功能（周寶利 等，2000）。各類病原物浸染可引起一些酚類代謝相關酶的活性增強（王茹華 等，2003），其中最常見的有苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化物酶、過氧化氫酶和多酚氧化酶等。木質素是沉積于植物木質化組織細胞壁中的芳香類化合物，可構成保護圈而阻止病菌侵入，其代謝產物對病菌還有毒害作用（周寶利 等，2000）。本試驗結果表明，接種根腐病菌后，砧木、嫁接和自根辣椒植株中的PAL活性與酚類物質含量呈現(xiàn)相同的變化趨勢，木質素含量顯著增加，說明受到病菌侵染后，植株會通過增強PAL活性，加速次生代謝，形成較多的酚類物質和木質素。高抗砧木根系中的PAL活性高，在豐富的苯丙烷類代謝前體糖供應基礎上，促進合成大量的酚類化合物及木質素是抗病砧木本身具有抗病性的重要遺傳基礎；嫁接后根系仍保持著砧木的代謝功能，因此，嫁接植株的PAL活性、酚類物質與木質素含量均顯著高于對照。這與周寶利等（2000）在茄子上的研究結果一致，說明苯丙烷類物質代謝增強是嫁接辣椒根腐病抗性增強的重要機理之一。砧木植株的PAL活性明顯高于嫁接植株，而其酚類物質含量則顯著低于嫁接植株，說明除PAL外，酚類物質代謝還受其他酶調控，PAL在莽草酸-苯丙烷類代謝中的作用及與酚類物質的關系還有待進一步研究。

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Relationship between Root Rot Resistance and Phenylaprapanoidmetabolism ingraft Capsicum

JIANG Fei1，LIU Ye-xia1，LIU Wei1，ZHENG Nan1，WANG Hong-tao2，AI Xi-zhen1*
（1College of Horticulture Science and Engineering，Shandong Agricultural University，State Key Laboratory of Crop Biology，Key Laboratory of Horticultural Crop Biology，Ministry of Agriculture，Tai’an271018，Shandong，China；2Zaozhuang Agriculturedemonstrationgarden，Zaozhuang277300，Shandong，China）

Changes ofdisease incidence anddisease index of root rot indifferent rootstock varieties of capsicum（Capsicum annuum L.）were investigated bymanual inoculation，with ‘Chifengtexuan’（Capsicum annuum L. var.grossum Bailey）as control.The result showed that‘Weishi’was taken sick later，and had the lowestdisease incidence anddisease index.This indicated it possessed strongdisease resistance among the four rootstock varieties and the control.Effect ofgrafting on root rot resistance and phenylaprapanoidmetabolism of capsicum were investigated with‘Chifengtexuan’sciongrafted onto‘Weishi’rootstock.The own-root plant was acting as control.The results showed that thedisease incidence anddisease index ofgrafted plants were lower than those of CK，but higher than those of rootstock plants.Before inoculation，rootstock andgrafted plants showed higher soluble sugar content and PAL activity in roots，but lower soluble sugar content and PAL activity in leaves，compared with the control.Similar phenolic compounds and lignin contents were found in roots and leaves of rootstock，grafted and control plants before inoculation.The soluble sugar content in roots of rootstock，grafted and control plantsdecreasedgradually after inoculation，PAL activity，contents of phenolic compounds and lignin increased at earlier stage，but trended to stabilize ordecrease10days later.Rootstock andgrafted plants showed significantly higher PAL activity and contents of phenolic compounds and lignin in roots and leaves than the control plants.Soluble sugar content in roots of rootstock andgrafted plants were also higher than that of the control plants，but in leaves were lower than the control plants.Thesedata indicated thatgrafting could significantly increase the root rot resistance in capsicum，and itsdisease resistantmechanism is closely related to the increase of phenylaprapanoidmetabolism.

Capsicum；Graft；Root rot；Phenylaprapanoid；Secondmetabolism

S436.418.1+9

A

1000-6346（2010）08-0046-07

2010-01-14；接受日期：2010-03-03

山東省財政支持重大應用技術創(chuàng)新課題資助

姜飛，碩士研究生，專業(yè)方向：蔬菜栽培生理，E-mail：dao198231@163.com

* 通訊作者（Corresponding author）：艾希珍，教授，博士生導師，專業(yè)方向：蔬菜生理與分子生物學，E-mail：axz@sdau.edu.cn