不同土炒白術中白術內酯Ⅲ和白術多糖的含量比較Δ

陳鴻平，劉友平，劉承萍，李 萍（成都中醫(yī)藥大學藥學院中藥材標準化教育部重點實驗室，成都市 610075）

不同土炒白術中白術內酯Ⅲ和白術多糖的含量比較Δ

陳鴻平＊，劉友平，劉承萍，李 萍（成都中醫(yī)藥大學藥學院中藥材標準化教育部重點實驗室，成都市 610075）

目的：探討不同輔料土炮制白術對其主要有效成分的影響，為輔料土的篩選提供依據。方法：采用同批藥材，用5種不同品種的輔料土炮制；采用高效液相色譜法測定白術內酯Ⅲ的含量，紫外分光光度法測定白術多糖的含量。結果：白術內酯Ⅲ的含量高低為赤石脂炒白術＞壁土炒白術＞灶心土炒白術＞窯土炒白術＞黃土炒白術＞生白術；多糖含量高低為灶心土炒白術＞黃土炒白術＞赤石脂炒白術＞窯土炒白術＞壁土炒白術＞生白術。結論：白術經不同輔料土炒炮制后，白術內酯Ⅲ和白術多糖含量均有增高，但不同炮制品之間無顯著性差異。

白術；土炒炮制；白術內酯Ⅲ；白術多糖

Δ四川省教育廳青年基金項目（2006B024）

＊實驗師，博士研究生。研究方向：中藥藥效物質基礎及質量標準。電話：028-61800231。E-mail：chen_hongping@126.com

白術為菊科植物白術Atractylodes macrocephalaKoidz.的干燥根莖，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎等功效[1]。傳統(tǒng)認為，白術生品燥濕力強，炮制后可緩和藥性，增強健脾和胃、補脾止瀉的功效。白術歷代炮制方法主要有熬制、土制、炒制、泔制、麩炒、醋制、煨制、焙制等，現代炮制方法多為清炒、土炒、麩炒、蜜炙等，其中土炒是最常見的炮制方法之一。白術土炒起源于晉、唐時期，常用的輔料土有黃土、壁土、灶心土，2005年版《中國藥典》（一部）規(guī)定使用灶心土。隨著社會發(fā)展，灶心土越來越難以獲得，各地出現的替代品種類不一，常使用的主要有黃土、窯土和赤石脂，均缺乏系統(tǒng)研究，嚴重影響了土炒炮制品的質量。而不同種類輔料土對土炒白術的質量影響尚未見文獻報道。本試驗采用歷代常用的灶心土、壁土、窯土、黃土、赤石脂等不同“土”作為輔料來炮制白術，對白術生品及各種土炮制品進行化學成分的定性定量比較研究，以白術多糖和白術內酯Ⅲ的含量為測定指標，對各種土炮制白術前后及相互之間的化學成分影響進行初步研究，以探討白術土炒炮制的意義，同時為輔料土的種類篩選提供依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC10-ATVP型高效液相色譜（HPLC）儀，包括紫外檢測器、色譜工作站（日本島津公司）；UV-1100型紫外-可見分光光度計（上海天美科技有限公司）；BP211D（十萬分之一）、BP121S（萬分之一）型電子分析天平（德國Sartorius公司）；BUG25-12型超聲波清洗機（25 kHz，500 W，上海必能信超聲波有限公司）。

1.2 試藥

白術內酯Ⅲ標準品（成都曼思特生物科技有限公司，批號：200810，純度＞98%）；葡萄糖標準品（成都市科龍化工試劑廠，批號：20081023）；赤石脂于2008年3月購于成都市西南藥都；灶心土來自四川廣元市劍閣縣某農家；窯土來自四川樂山市夾江縣某農家；壁土來自四川樂山市夾江縣某農家；黃土采自成都市溫江區(qū)；白術于2008年3月購于西南藥都，經成都中醫(yī)藥大學裴瑾教授鑒定為植物白術A.macrocephalaKoidz.的干燥根莖；甲醇、乙腈為色譜純，水為高純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 不同土炒白術炮制品的制備

取上述各種土過120目篩的細粉，分別投入熱鍋中，加熱至呈滑利狀態(tài)時，投入凈白術片，迅速翻炒，炒至白術表面均勻掛土色時，取出，篩去土粉，放涼，備用。即得赤石脂炒白術、灶心土炒白術、窯土炒白術、壁土炒白術、黃土炒白術5種白術炮制品。每100 g藥材用輔料土20 g。

2.2 不同土炒白術炮制品中白術內酯Ⅲ的含量比較

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱：Hypersil-ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（65∶35）；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：220 nm。在此色譜條件下，供試品溶液中白術內酯Ⅲ與其余成分完全分離；理論板數以白術內酯Ⅲ峰計算應不低于3 000。色譜見圖1。

2.2.2 標準品溶液的制備 精密稱取白術內酯Ⅲ標準品10.6 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得標準品貯備液。精密量取標準品貯備液1 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得標準品溶液。

圖1 高效液相色譜圖A.白術內酯Ⅲ標準品；B.供試品；1.白術內酯ⅢFig 1 HPLC chromatogramsA.atractylodeⅢ standard substance；B.test sample；1.atractylodeⅢ

2.2.3 供試品溶液的制備 分別取白術生品及5種土炒炮制品細粉約1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，稱重，超聲40 min，放冷，再稱重，用甲醇補足失重，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，蒸干，殘渣加甲醇溶解并定容至2 mL量瓶中，搖勻，以微孔濾膜（0.45 μm）濾過，即得。

2.2.4 線性關系考察 分別精密吸取標準品貯備液0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，取上述溶液各10 μL，按上述色譜條件測定。以峰面積積分值（Y）為縱坐標，白術內酯Ⅲ進樣量（X，μg）為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程為Y＝3×106X+12 090（r＝0.999 8）。結果表明，白術內酯Ⅲ進樣量在0.265～2.120 μg范圍內與峰面積積分值呈良好的線性關系。

2.2.5 重復性試驗 取白術生品細粉約1 g，共6份，精密稱定，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，各吸取10 μL，照上述色譜條件測定。結果，RSD＝1.32%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.2.6 精密度試驗 精密吸取白術內酯Ⅲ標準品溶液適量，按上述色譜條件重復進樣測定6次。結果，RSD＝0.97%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一灶心土炒白術供試品溶液10 μL，按上述色譜條件分別于0、12、24、48、72、96 h測定。結果，RSD＝1.23%（n＝6），表明供試品溶液在96 h內穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收率試驗 取已知含量的生白術細粉約0.5 g，共6份，精密稱定，分別加入白術內酯Ⅲ標準品溶液0.5 mL，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，各精密吸取10 μL，按上述色譜條件測定，計算加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 1Results of recovery test（n＝6）

2.2.9 樣品含量測定 取各種土炒白術，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取各供試品溶液10 μL，按上述色譜條件測定，計算白術內酯Ⅲ含量。結果，白術經不同土炒后白術內酯Ⅲ含量均顯著增高，除黃土炒白術含量稍低外，其余4種炮制品無顯著性差異。樣品含量測定結果見表2。

2.3 不同土炒白術炮制品中多糖的含量比較

2.3.1 標準品溶液的制備 精密稱取葡萄糖標準品（于105℃干燥至恒重）50.0 mg，置于50 mL量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，得葡萄糖標準品貯備液。精密吸取貯備液5 mL，置于50 mL量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，得葡萄糖標準品溶液。

表2 樣品含量測定結果Tab 2 Content determination of samples

2.3.2 供試品溶液的制備 分別取白術生品及5種土炒炮制品粗粉（過2號篩）約1 g，精密稱定，置于250 mL具塞錐形瓶中，加入70%的乙醇50 mL，冷浸2 h，超聲提取20 min，濾過，藥渣用70%的熱乙醇洗滌后揮干乙醇，加入50 mL蒸餾水回流提取1 h，趁熱過濾，藥渣及燒瓶用少量熱蒸餾水洗滌，洗滌液并入濾液，置于100 mL量瓶中，冷卻至室溫后加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，得供試品貯備液。精密吸取貯備液1 mL，置于100 mL量瓶中，加蒸餾水釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.3.3 顯色條件的考察及最大吸收波長的確定 文獻報道[2]，苯酚-濃硫酸法測定多糖含量時影響因素主要有顯色溫度、顯色時間和顯色劑（10 mL蒸餾水加入50 mL濃硫酸中，于冰水浴中冷卻，再加入0.6 g苯酚晶體，超聲溶解，即得）用量，故本試驗對這3個影響因素進行了考察。

（1）顯色溫度的考察：分別考察了45、70、100℃3種溫度對供試品、標準品溶液的最大吸收波長和吸光度的影響。結果，100℃時，標準品、供試品溶液均在490 nm波長處有最大吸收，故選用100℃為顯色溫度，490 nm波長為測定波長。紫外吸收光譜見圖2。

圖2 紫外吸收光譜圖a.葡萄糖標準品；b.生白術供試品Fig 2 UV absorption spectruma.standard glucose；b.A.macrocephala samples

（2）顯色時間的考察：精密移取生白術供試品溶液2 mL，共4份，置于具塞試管中，各組分別以2 mL蒸餾水為空白、1 mL葡萄糖標準品溶液精密加蒸餾水至2 mL為對照品，分別加顯色劑5 mL，搖勻，放置10 min，分別于100℃水浴顯色10、20、30、40 min，取出，靜置20 min，于490 nm波長處測定吸光度。結果，顯色30 min后吸光度不再增加，故確定顯色時間為30 min。

（3）顯色劑用量的考察：精密移取生白術供試品溶液2 mL，共5份，置于具塞試管中，各組分別以2 mL蒸餾水為空白，分別加顯色劑3、4、5、6、7 mL，搖勻，放置10 min，分別于100℃水浴顯色30 min，取出，靜置20 min，于490 nm波長處測吸光度。結果，當顯色劑用量為5 mL后吸光度不再增加，故確定顯色劑用量為5 mL。

最終確定測定白術多糖的顯色條件為供試品溶液2 mL，加顯色劑5 mL，搖勻，放置10 min，于沸水浴加熱30 min，取出，冷卻至室溫，于490 nm波長處測定吸光度。

2.3.4 標準曲線的制備 精密吸取葡萄糖標準品溶液0.0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6 mL，置于具塞試管中，蒸干，精密加入蒸餾水2 mL溶解殘渣，加顯色劑5 mL，搖勻，放置10 min，沸水浴加熱30 min，取出，冷卻至室溫，于490 nm波長處測定吸光度。以吸光度（A）為縱坐標，葡萄糖檢測濃度（C，g·L-1）為橫坐標，制備標準曲線，得回歸方程為A＝13.363C+0.023 9（r＝0.999 3）。結果表明，葡萄糖檢測濃度在0.02～0.08 g·L-1范圍內與吸光度呈良好線性關系。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 精密移取生白術供試品溶液2 mL，置于具塞試管中，按“2.3.4”項下自“加顯色劑5 mL”起操作，每隔30 min測定吸光度，共測定5次。結果，RSD＝1.25%（n＝5），表明供試品溶液在120 min內穩(wěn)定。

2.3.6 精密度試驗 精密移取葡萄糖標準品溶液0.8 mL，共6份，分別置于具塞試管中，按“2.3.4”項下自“加顯色劑5 mL”起操作，在490 nm波長處測定吸光度。結果，平均吸光度為0.575，RSD＝1.05%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.3.7 不同土炒白術炮制品中精制多糖的制備 分別稱取白術生品及各種土炮制品粗粉（過2號篩）50 g，加6倍量70%乙醇回流提取2次，每次2 h，濾過，以除去單糖、低聚糖、苷類及生物堿等干擾性成分。藥渣加8倍量水煎煮2次，每次1.5 h，合并水煎液，濃縮至100 mL（相當于藥材0.5 g·mL-1），靜置過夜，取上清液，3 500 r·min-1離心30 min，取離心后上清液加入95%乙醇調至乙醇濃度為70%，冰箱靜置24 h，濾過，沉淀用蒸餾水溶解，3 500 r·min-1離心30 min，上清液再加入95%乙醇調至乙醇濃度為70%，冰箱靜置24 h，濾過，沉淀用無水乙醇反復洗滌，60℃真空干燥，即得不同土炒白術的精制多糖。

2.3.8 換算因子的測定 精密稱取精制多糖50 mg，置于50 mL量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取1 mL，置于25 mL量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。精密吸取該溶液2 mL，置于具塞試管中，在490 nm波長處測定吸光度，計算以葡萄糖計的質量，按下式計算換算因子（f）：f＝W/W1（式中：W為多糖的質量（g）；W1為多糖供試液中以葡萄糖計的質量（g））。

2.3.9 加樣回收率試驗 取已知多糖含量的生白術細粉約0.5 g，共6份，精密稱定，分別精密加入葡萄糖標準品0.25 g，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，在490 nm波長處測定吸光度，計算加樣回收率，結果見表3。

表3 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 3Result of recovery experiment（n＝6）

2.3.10 樣品含量測定 精密吸取各供試品溶液2 mL，置于具塞試管中，按“2.3.4”項下方法測定吸光度，計算以葡萄糖計的濃度，按下式計算樣品中多糖的含量：多糖含量（%）＝W1f1/W2×100%（式中：W1為多糖供試液中以葡萄糖計的質量；f為換算因子；W2為白術取樣量（g））。結果表明，土炒后白術多糖含量略有增高，但不同土炒品之間無顯著差異。樣品多糖含量測定結果見表4。

表4 樣品多糖含量測定結果（n＝3）Tab 4 Content determination of polysacchenide in samples（n＝3）

3 討論

試驗結果表明，白術土炒炮制后白術內酯Ⅲ和多糖的含量均顯著增高，其中白術內酯Ⅲ含量增加尤為明顯，約為生品的3至4倍，與文獻報道[3]一致。白術多糖具有提高機體免疫能力、增強機體對自由基的清除、抗氧化的作用；白術內酯Ⅲ則具有抗炎和抗癌作用，二者含量在炮制后均明顯提高，可為土炒炮制這一方法提供一定的科學依據。

不同土炒白術中白術內酯Ⅲ的含量高低為赤石脂炒白術＞壁土炒白術＞灶心土炒白術＞窯土炒白術＞黃土炒白術，除黃土炒白術含量稍低外，其余4種炮制品無顯著性差異。不同土炒白術中多糖的含量高低為灶心土炒白術＞黃土炒白術＞赤石脂炒白術＞窯土炒白術＞壁土炒白術，但均無顯著性差異。結果表明，不同種類的輔料土炮制對白術多糖和內酯類成分的影響不大，但并不能就此說明這幾種土均能替代灶心土使用，還應對其藥理作用和毒理進行系統(tǒng)比較研究，以最終篩選和確定輔料土的種類，保證土炒飲片的臨床療效和用藥安全。

[1]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2005年版.北京：化學工業(yè)出版社，2005：68.

[2]李 輝，羅佳波.苯酚-硫酸法測定圍樂顆粒中總多糖的含量[J].中國藥房，2008，19（9）：685.

[3]于永明，宋長義，賈天柱.白術炮制品的質量標準研究[J].中成藥，2005，27（6）：669.

Content Comparison of AtractylodeⅢand Soluble Polysaccharide ofAtractylodes macrocephalaProcessed with Different Kinds of Soils

CHEN Hong-ping，LIU You-ping，LIU Cheng-ping，LI Ping（Key Lab of TCM Standardization，Ministry of Education，Pharmacy College of Chengdu University of TCM，Chengdu 610075，China）

OBJECTIVE：To discuss on the effect of processedAtractylodes macrocephalawith different kinds of soils as excipient on the main effective ingredients ofA.macrocephala，and to provide the basis for screening soils as processing excipient.METHODS：The same batches ofA.macrocephalawere processed with 5 kinds of soils.The content of atractylodeⅢ was determined by HPLC and polysaccharide ofA.macrocephalaby UV spectrophotometry.RESULTS：The contents of atractylodeⅢ in processedA.macrocephalaby halloysitum rubrum was the highest，followed by processedA.macrocephalaby wall soil，by kitchen range soil，by kiln soil，by loess and raw material.The contents of soluble polysaccharide in processedA.macrocephalaby kitchen range soil was the highest，followed by processedA.macrocephalaby loess，by halloysitum rubrum，by kiln soil，by wall soil and raw material.CONCLUSION：The contents of atractylodeⅢ and polysaccharide increase afterA.macrocephalahas been processed by different kinds of soil.However，there is no significant difference among the processedA.macrocephalawith different kinds of soils.

Atractylodes macrocephala；Processed by soil；AtractylodeⅢ；Polysaccharide ofAtractylodes macrocephala

R284.2；R284.1

A

1001-0408（2010）39-3680-04

2009-10-03

2010-05-06）