甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化中不同階段潮霉素抗性篩選

姚 麗 ，吳才文 ，曾千春

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；2.云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室，開遠(yuǎn) 661600）

甘蔗（Saccharum offcinarum L.）屬禾本科（Gramineae）甘蔗屬（Saccharum），是重要的糖料和能源作物，蔗糖約占世界食糖總產(chǎn)量的70%～80%，而在我國達90%以上，甘蔗也是生產(chǎn)燃料乙醇和一些天然化合物的重要原料，榨汁后的蔗渣還可用于造紙[1]。甘蔗更是云南僅次于煙草的重要經(jīng)濟作物，也是未來重要能源作物。其遺傳背景較復(fù)雜，是非整倍性異源多倍體作物，孕穗、開花及花期相遇困難，常規(guī)雜交育種難度大、周期長，新育成的高產(chǎn)優(yōu)良品系因某一性狀欠佳而不能推廣應(yīng)用常有發(fā)生[2]。故采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)迅速改良現(xiàn)有品種的研究工作日益增多，且已有了相關(guān)成功報道[3-6]，而能否成功的關(guān)鍵因素之一就在于能否確定適宜的篩選試劑及濃度，從而淘汰非轉(zhuǎn)化體。

在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化中，磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（hpt）一直作為有效的標(biāo)記基因，其選擇試劑潮霉素B（Hygromycin B，簡稱Hyg）與卡那霉素一樣，是一種氨基糖苷類抗生素（Gritz and Davis，1983），它來源于鏈球菌（Streptomyces hygroscopicus），Linda等（1983）從大腸桿菌中克隆出hpt，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌和酵母菌中，得到了潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子[7]。從1989年開始hpt基因成為主要的篩選標(biāo)記基因，其編碼的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶可將磷酸基團共價地加到Hyg的第4位上，通過酶促磷酸化作用而使Hyg失活，從而產(chǎn)生抗性，因此在含Hyg的培養(yǎng)基中，含有該標(biāo)記基因的植株能存活而不含該標(biāo)記基因的植株死亡。Hyg有選擇效率高、基因型差異小、對轉(zhuǎn)化細(xì)胞和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞區(qū)分明顯、對轉(zhuǎn)化細(xì)胞不產(chǎn)生或很少產(chǎn)生毒害作用，而且很少出現(xiàn)白化苗、再生植株的可育性也較好等優(yōu)點，在水稻、玉米和小麥等作物上得到了廣泛應(yīng)用，是單子葉植物較為理想的篩選試劑[8-11]。因此，在甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化前確定潮霉素在組織培養(yǎng)各階段的使用濃度，對轉(zhuǎn)化時淘汰那些未轉(zhuǎn)化組織或組培苗提供了重要依據(jù)。

本試驗通過觀測新臺糖22對Hyg的敏感性，為確定甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化時各階段的最佳抗性篩選濃度提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

新臺糖22，由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所提供。潮霉素B（Hyg）為sigma公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基 （1）誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基 M1：MS+2,4-D1mg/L；（2）分化培養(yǎng)基 M2：MS+6-BA1mg/L+NAA0.1 mg/L；（3）生根培養(yǎng)基M3：1/2 MS+NAA1 mg/L+蔗糖20g/L。以上培養(yǎng)基皆為固體培養(yǎng)基，未特別注明的則瓊脂7g/L，蔗糖 30g/L，AC 0.2g/L，pH5.8。

1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo) 取甘蔗幼嫩葉鞘為外植體，在M1培養(yǎng)基上誘導(dǎo)胚性愈傷組織產(chǎn)生。

1.2.3 潮霉素抗性篩選預(yù)試驗 Hyg設(shè)5個梯度，10、20、30、40、50 mg/L。將在M1中生長旺盛的胚性愈傷組織，分別接種到添加Hyg的M1、M2及M3培養(yǎng)基中。M1、M2培養(yǎng)基中每瓶接種20塊愈傷組織，每塊直徑2～3mm；M3培養(yǎng)基中每瓶接種15株3～4cm高、生長健壯的無根苗。每個處理接種3瓶，設(shè)置3次重復(fù)，每5d觀察記載愈傷組織生長、褐化死亡、分化及生根情況。

1.2.4 計算公式 誘導(dǎo)率（%）=愈傷數(shù)/接入外植體數(shù)×100；死亡率（%）=死亡愈傷（芽）數(shù)/接入愈傷數(shù)×100；分化率（%）=抗性芽數(shù)/接入愈傷數(shù)×100；生根率（%）=長根苗數(shù)/接入苗數(shù)×100。

2 結(jié)果與分析

將生長均勻、鮮黃疏松的胚性愈傷組織接種于含不同Hyg濃度的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)15d后觀察統(tǒng)計，見表1。結(jié)果顯示：Hyg對甘蔗愈傷組織影響較大，隨著Hyg濃度的增高，愈傷組織死亡率也逐漸增大（見圖 1、圖 2）。 當(dāng) Hyg=10、20mg/L 時，愈傷組織死亡率分別為53.33%、62.22%，都有部分芽分化，分化率均為3.33%；當(dāng)Hyg=30mg/L時，死亡率增至66.67%，沒有芽的產(chǎn)生，而且40d內(nèi)基本死亡；Hyg增至40mg/L時，死亡率為72.22%，30d內(nèi)基本死亡；Hyg增至50mg/L時，死亡率達84.44%，死亡速度加快，30d內(nèi)完全死亡（圖2）。因此，甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化時篩選抗性愈傷組織的Hyg濃度應(yīng)為50mg/L。

2.1 潮霉素對甘蔗愈傷組織的影響

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2.2 潮霉素對甘蔗愈傷組織分化成芽的影響

由表1可看出，Hyg對甘蔗的愈傷組織的分化有更強烈的毒性作用。當(dāng)Hyg=10mg/L時，有部分芽的產(chǎn)生，隨著時間的增加分化率呈現(xiàn)出先增后減的趨勢（圖3），15d時達最大值，分化率為7.78%，愈傷組織死亡率為92.22%；當(dāng)Hyg=20mg/L時，沒有芽的分化，且愈傷先是暗淡松軟、失水，最后逐漸褐化，死亡率增至95.56%；當(dāng)Hyg=30mg/L時，10d內(nèi)就幾乎沒有成活愈傷，15d內(nèi)全部褐化死亡；當(dāng)Hyg濃度增至40、50mg/L，愈傷組織10d內(nèi)全部死亡。因此，質(zhì)量濃度為30mg/L的Hyg可作為甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化時芽分化階段的篩選濃度。

2.3 潮霉素對甘蔗試管苗生根的影響

Hyg對甘蔗試管苗生根的梯度試驗表明，Hyg對甘蔗幼苗的生根及生長也有較強的抑制作用。在不加Hyg的對照中，苗均能生根，且有主側(cè)根、植株粗壯、葉色濃綠。當(dāng)加入Hyg后，幼苗的發(fā)根及生長嚴(yán)重受阻，且隨濃度的增加，生根率逐漸下降至零（見圖4），植株細(xì)弱、葉色較淡，并逐漸黃化、枯死。

表1表明，當(dāng)Hyg濃度為10、20mg/L時，均有根的生成；隨著Hyg濃度增至30～50mg/L時，均沒有根的生成，并逐漸黃化枯死。Hyg=10mg/L時，生根率為11.11%，60d內(nèi)基本死亡；而當(dāng)Hyg=20mg/L時，生根率降至3.33%，40d內(nèi)基本死亡；在Hyg=30mg/L時，生根率為0，30d內(nèi)逐漸黃化枯死；Hyg=40、50mg/L時，同樣不能生根，30d內(nèi)植株很快枯死，但與30mg/L沒有顯著差異。因此，Hyg濃度為30mg/L應(yīng)是甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化時生根階段的最適篩選濃度。

3 討論

本試驗通過新臺糖22對含不同濃度Hyg的不同培養(yǎng)基的敏感性，確定今后甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化時的篩選濃度。試驗結(jié)果表明，在相同濃度不同培養(yǎng)基中Hyg毒性作用不同，即在Hyg濃度為10mg/L時，無論是在誘導(dǎo)培養(yǎng)基還是分化培養(yǎng)基中都有芽的分化，且在分化培養(yǎng)基中不定芽分化率、愈傷死亡率都是誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的兩倍，生根率為11.11%；當(dāng)Hyg=20mg/L時，在分化培養(yǎng)基中已沒有芽的分化、死亡率達95.66%，而在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中仍有芽的分化、死亡率僅為62.22%，生根率降至3.33%；而當(dāng)Hyg=30mg/L時，兩個階段都已經(jīng)不能分化芽，且已經(jīng)完全不能生根，但在芽分化階段，10d內(nèi)就幾乎沒有愈傷成活，15d內(nèi)全部褐化死亡，而在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，15d時愈傷死亡率僅為66.67%，30d左右才能將其完全致死。在同一培養(yǎng)基、不同Hyg濃度時其抑制作用也存在差異，如在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，Hyg=50mg/L在30d內(nèi)才能完全抑制愈傷組織的生長及分化，并將其完全致死；而在分化培養(yǎng)基中，當(dāng)Hyg=30mg/L時就能在15d之內(nèi)完全將其致死；在生根培養(yǎng)基中，當(dāng)Hyg=30mg/L時已經(jīng)完全不能生根，并在30d內(nèi)逐漸黃化枯死。

由此我們可以得出以下結(jié)論：Hyg對不同階段培養(yǎng)基的敏感性存在一定差異，其毒性作用順序是分化培養(yǎng)基＞生根培養(yǎng)基＞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，且在甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化時，在分化培養(yǎng)基及生根培養(yǎng)基中的抗性篩選濃度均應(yīng)為30mg/L，而在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中則以Hyg≥50mg/L為佳。因此，筆者認(rèn)為遺傳轉(zhuǎn)化時可直接將Hyg=30mg/L用于分化培養(yǎng)基進行抗性愈傷及芽篩選試驗，然后再用Hyg=30mg/L進行生根篩選，不僅節(jié)約成本，還能在短時間內(nèi)及時有效的淘汰掉大部分非轉(zhuǎn)化體。本研究結(jié)果為供試品種的遺傳轉(zhuǎn)化提供了重要依據(jù)。

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