阿膠低肽酶解工藝的實(shí)驗(yàn)研究

付英杰, 田景振

(山東中醫(yī)藥大學(xué),山東濟(jì)南 250355)

阿膠低肽酶解工藝的實(shí)驗(yàn)研究

付英杰, 田景振＊

(山東中醫(yī)藥大學(xué),山東濟(jì)南 250355)

阿膠;低肽;酶解工藝

阿膠為馬科動(dòng)物驢Equus asinusL.的干燥皮或鮮皮經(jīng)煎煮、濃縮制成的固體膠。性味甘、平,歸肺肝腎經(jīng),功能補(bǔ)血、止血、滋陰潤(rùn)燥,主治血虛證,另可作腫瘤的輔助治療[1,2]。

阿膠主含膠原蛋白,但膠原蛋白的消化吸收需要蛋白酶參與降解,而適應(yīng)癥人群則常見(jiàn)脾胃虛弱或胃腸道反應(yīng),服用阿膠不僅會(huì)造成患者消化系統(tǒng)的負(fù)擔(dān),而且藥效也不能得到充分的發(fā)揮。目前市售阿膠類制劑均以阿膠藥材為原料,無(wú)法克服上述缺點(diǎn)。為使阿膠類制劑更好地發(fā)揮療效,并使其酶解工藝可控,筆者擬模仿消化道內(nèi)的條件,以測(cè)定的有效低肽含量的得率為指標(biāo),優(yōu)化阿膠酶解的最佳工藝。

1 儀器與試劑

SYC-15超級(jí)恒溫水浴(南京桑力電子設(shè)備廠);LD4-2A低速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠);PHS-3C精密型pH計(jì)(上海三信儀表廠);中空纖維超濾裝置(北京市旭邦膜設(shè)備有限責(zé)任公司);紫外分光光度計(jì)(日立UV-3010)。

阿膠購(gòu)自濟(jì)南建聯(lián)中藥店;胃蛋白酶(Pepsin,BR;活力1:300 0,批號(hào):F20031224,購(gòu)于中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司);胰蛋白酶(Trypsin,BR;活力1:250 0,批號(hào): F20041022,購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);牛血清白蛋白(Albumin,Bovine Biotech,批號(hào):B67328,購(gòu)于上海生工生物工程有限公司);考馬斯亮藍(lán)(Coomassie Brilliant Blue G-250 Ultra Pure,批號(hào):0241B75,購(gòu)于上海生工生物工程有限公司);其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定方法的建立[3]

考馬斯亮藍(lán)G-250的最大吸收波長(zhǎng)為488 nm,當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后形成蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物,在595 nm波長(zhǎng)下有最大吸收。其吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比,因此可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。該染色過(guò)程原理是通過(guò)范德華力將染料分子與蛋白質(zhì)或肽分子結(jié)合[4],分子量越小,結(jié)合力越小。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)得知,當(dāng)分子量MW t.<1kD(千道爾頓)時(shí),A595在可允許誤差以內(nèi)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:分別取六只試管,其中一只加入1.0 mL蒸餾水做空白,5只分別加入不同體積的濃度為100μg/mL牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液,補(bǔ)充水到1.0 mL。然后每只試管加入5.0 mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑,搖勻放置5 min,采用玻璃比色皿,在紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)595 nm處測(cè)定吸光度。以A595為縱坐標(biāo),牛血清白蛋白的數(shù)(μg)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品溶液的制備與測(cè)定:配制濃度約100μg/mL的待測(cè)阿膠低肽溶液。取一支試管加入1.0 mL蒸餾水做空白,一支加入0.5 mL待測(cè)阿膠低肽溶液,補(bǔ)充水到1.0 mL。然后每支試管加入5.0 mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑,搖勻放置5 min后,用玻璃比色皿在紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)595 nm處測(cè)定吸光度。用測(cè)得的吸光度從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相當(dāng)于牛血清白蛋白的數(shù)量(μg),計(jì)算出待測(cè)低肽的含量。

蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合在2 min左右的時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡,其結(jié)合物在室溫下1 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.2 影響酶解因素的考察

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[5],一般酶解需要考察的因素有溫度、pH值、加酶量、酶解時(shí)間。由于用本工藝提取阿膠有效部位未見(jiàn)報(bào)道,故需要通過(guò)單因素試驗(yàn)摸索其提取條件,以確定各因素的水平。本實(shí)驗(yàn)的pH值和溫度分別采用胃蛋白酶和胰蛋白酶的最適pH值和最適溫度,以便使酶發(fā)揮最大活力,節(jié)省酶的用量。本實(shí)驗(yàn)以模擬人體內(nèi)蛋白水解的過(guò)程,采用蛋白酶水解法,分別進(jìn)行各項(xiàng)單因素考察。在預(yù)試驗(yàn)結(jié)果及確定阿膠低肽量效關(guān)系的基礎(chǔ)上,以阿膠MW t.(分子量)<3 kD低肽含量的得率為指標(biāo),通過(guò)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定結(jié)果優(yōu)選最佳酶解工藝,最后進(jìn)行低肽含量及藥效驗(yàn)證。

預(yù)實(shí)驗(yàn)工藝流程如下(注:為節(jié)省空間,胃蛋白酶簡(jiǎn)寫為胃酶,胰蛋白酶簡(jiǎn)寫為胰酶):

預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:確定酶的最適pH為pH2.0和pH8.0;而最適溫度則需要單因素考察。

2.2.1 提取溫度考察 取粉碎的阿膠2.5 g,用20倍水溶解,80℃水浴加熱30 min,冷卻至室溫,調(diào)pH值至2.0,加胃蛋白酶10萬(wàn)U/g,按表1內(nèi)不同溫度進(jìn)行考察。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)工藝流程配得樣品若干,用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定MW t.<3 kD低肽含量[6],計(jì)算MW t.<3 kD阿膠低肽的收率,結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 溫度單因素考察結(jié)果

結(jié)果表明,42℃下進(jìn)行酶解為最佳酶解溫度,故以下單因素考察及正交試驗(yàn)均以42℃為酶解溫度。

2.2.2 胃蛋白酶酶解時(shí)間考察 按2.2.1項(xiàng)下方法進(jìn)行操作,固定其他各因素,僅胃蛋白酶酶解時(shí)間變化,計(jì)算MW t. <3 kD阿膠低肽的收率,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 胃蛋白酶酶解時(shí)間考察結(jié)果

2.2.3 胃蛋白酶酶量考察 按2.2.1項(xiàng)下方法進(jìn)行操作,固定其他各因素,僅胃蛋白酶加入量變化,計(jì)算MW t.<3 kD阿膠低肽的收率,結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 胃蛋白酶酶量考察結(jié)果

2.2.4 胰蛋白酶酶解時(shí)間考察 按2.2.1項(xiàng)下方法進(jìn)行操作。固定其他各因素,僅胰蛋白酶酶解時(shí)間變化,計(jì)算MW t.<3 kD阿膠低肽的收率,結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 胰蛋白酶酶解時(shí)間考察結(jié)果

2.2.5 胰蛋白酶酶量考察 按2.2.1項(xiàng)下方法進(jìn)行操作。固定其他各因素,僅胰蛋白酶加入量變化,計(jì)算MW t.<3 kD阿膠低肽的收率,結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 胰蛋白酶酶量考察結(jié)果

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果,以考馬斯亮藍(lán)測(cè)得的濃度為指標(biāo),考察胃蛋白酶酶解時(shí)間、胃蛋白酶酶量、胰蛋白酶酶解時(shí)間和胰蛋白酶酶量4個(gè)因素對(duì)有效成分提取的影響。以L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn),每次實(shí)驗(yàn)稱取阿膠粉2.5 g,以正交試驗(yàn)表中各水平按預(yù)實(shí)驗(yàn)工藝流程操作,最后配成MW t.<3 kD的阿膠低肽提取液100 mL,計(jì)算收率。因素水平見(jiàn)表6,正交試驗(yàn)及結(jié)果見(jiàn)表7,方差分析見(jiàn)表8。

表6 因素水平表

表7 正交試驗(yàn)及結(jié)果

表8 方差分析

以考馬斯亮藍(lán)測(cè)得的MW t.<3 kD低肽含量為指標(biāo),表中的極差R的大小顯示各因素作用主次為:胃蛋白酶酶量>胰蛋白酶酶解時(shí)間>胃蛋白酶酶解時(shí)間>胰蛋白酶酶量。表中的方差分析表明:胃蛋白酶酶量和胃、胰蛋白酶酶解時(shí)間有顯著性意義。從直觀分析得知最佳提取工藝組合為: A2B2C2D2。從實(shí)際的生產(chǎn)上考慮,為了節(jié)省蛋白酶的用量,且胰蛋白酶酶量因素在酶解過(guò)程中影響小,故采用A2B2C1D2,即胃蛋白酶酶量10萬(wàn)U/g、胃蛋白酶酶解時(shí)間2 h、胰蛋白酶酶量5千U/g、胰蛋白酶酶解時(shí)間3 h為最佳提取工藝。

2.4 驗(yàn)證性試驗(yàn)

取粉碎的阿膠2.5 g,用20倍水溶解,80℃水浴加熱30 min,冷卻至室溫,加胃蛋白酶10萬(wàn)U/g,42℃酶解2 h,冷卻至室溫,調(diào)pH值至8.0,加胰蛋白酶5千U/g,酶解3 h。測(cè)定MW t.<3 kD低肽含量,進(jìn)行工藝驗(yàn)證,結(jié)果見(jiàn)表9。

2.5 藥效驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

取體重(20±2)g的小鼠10只,每天注射環(huán)磷酰胺50 mg/kg,連續(xù)5 d,造模后24 h將小鼠固定于特制的小鼠固定籠具,尾部用溫水加溫,使小鼠尾部充血,用剪刀剪斷尾尖,取血,檢測(cè)Hb、RBC和白細(xì)胞數(shù),作為給藥前的血常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)。然后于第6天開(kāi)始每天腹腔注射最佳工藝的MW t.<3 kD的阿膠低肽藥液0.05 mL,于14 d斷尾取血,檢測(cè)Hb(血紅蛋白)、RBC(紅細(xì)胞)和WBC(白細(xì)胞)數(shù),結(jié)果見(jiàn)表10。

表9 驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

表10 藥效驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=10)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明:阿膠低肽的量效關(guān)系是可靠的。以分子量<3 kD肽的含量為指標(biāo),利用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選了阿膠酶的提取工藝,同時(shí)進(jìn)行藥效驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),兩種方法所得結(jié)論一致。證實(shí)了用最佳酶解工藝制得的阿膠低肽是有效且穩(wěn)定的。

3 小結(jié)與討論

3.1 用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定多肽含量,是因?yàn)橹苽涞碾臑橥ㄟ^(guò)了超濾而得到的MW t.<3 kD的低肽,且已證實(shí)MW t.在1 kD～3 kD為有效分子量范圍,并且小分子量的氨基酸加入考馬斯亮藍(lán)不顯色,而MW t.<1 kD的小肽一方面含量低,另一方面由于小肽分子量小,與染料之間的范德華力小,結(jié)合力差。實(shí)驗(yàn)證實(shí)阿膠低肽酶解液中的MW t.<1 kD的部分在可允許誤差范圍內(nèi)。故用此方法可以很好地測(cè)定有效肽的含量,并能表示藥效強(qiáng)弱,在本實(shí)驗(yàn)中亦得到了驗(yàn)證。

3.2 本實(shí)驗(yàn)得到的最佳酶解工藝:酶解溫度為42℃、胃蛋白酶酶解pH為2.0、胃蛋白酶酶量10萬(wàn)U/g、胃蛋白酶酶解時(shí)間為2 h、胰蛋白酶酶解pH為8.0、胰蛋白酶酶量為5千U/g、胰蛋白酶酶解時(shí)間為3 h。

3.3 單因素考察結(jié)果較正交試驗(yàn)結(jié)果并不完全對(duì)應(yīng),可能原因在于單因素實(shí)驗(yàn)采用的蛋白酶酶解時(shí)間短(1.5 h),胃蛋白酶與胰蛋白酶酶解時(shí)間有交互作用,蛋白酶酶切位點(diǎn)等有關(guān),具體原因有待進(jìn)一步考察。

3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)得到的MW t.<3 kD的阿膠低肽收率為22.48%。經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),MW t.>3 kD的部分仍有一定量未完全酶解的大分子量蛋白,若將超濾后的濃集液進(jìn)行二次或多次酶解,可提高M(jìn)W t.<3 kD阿膠低肽的收率,但多次酶解需要結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)成本進(jìn)行計(jì)算。

[1] 雷載權(quán).中藥學(xué)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1995:303.

[2] 魏 東,王 瑛,張 濤,等.大劑量阿膠治療晚期腫瘤化療后血小板減少癥的臨床研究[J].成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2002,25 (1):32.

[3] 汪家政,范 明.蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社, 2000:42-47.

[4] 陸 健.蛋白質(zhì)純化技術(shù)及應(yīng)用[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2005:173.

[5] 宋煥祿.動(dòng)物蛋白酶解研究(Ⅱ)[J].食品科學(xué),2001,22(6): 28.

[6] 付英杰,田景振.考馬斯亮藍(lán)法對(duì)阿膠低肽含量測(cè)定的方法學(xué)研究[A].中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)制劑分會(huì)第九屆學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C].長(zhǎng)春:中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)制劑分會(huì),2008:289.

R284.2

B

1001-1528(2010)01-0143-04

2008-11-12

付英杰(1983-),男,博士研究生。研究方向:中藥制劑。Tel:(0531)89628597 E-mail:pilipili@163.com

＊通訊作者:田景振(1957-),教授,博士生導(dǎo)師。Tel:(0531)89628080 E-mail:tianjingzhen@163.com