線性掃描伏安法測(cè)定維生素B2

沈崢 習(xí)霞 明亮

1 無(wú)錫高等師范學(xué)校 江蘇無(wú)錫 214001 2 南通大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 江蘇南通 226019

1 前言

維生素B2（Vitamine B2，簡(jiǎn)寫為VB2），又稱核黃素，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示，它是黃素單核苷酸（FMN）和黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的重要組成部分，而FMN和FAD是生物體內(nèi)的重要輔酶，具有催化生物氧化還原的功能，參與生物體內(nèi)的許多重要代謝活動(dòng) 。同時(shí)維生素B2也是常用藥物，廣泛用于食品、醫(yī)藥和生化等領(lǐng)域。因此，建立靈敏、可靠、簡(jiǎn)便的維生素B2測(cè)定方法具有重要的實(shí)際意義。目前測(cè)定維生素B2的方法主要有分光光度法[1]、熒光法[2]以及電化學(xué)分析方法[3-4]等。

圖1 維生素B2的化學(xué)結(jié)構(gòu)

碳納米管是20世紀(jì)90年代初發(fā)現(xiàn)的一種具有獨(dú)特電學(xué)性能、大比表面積、強(qiáng)吸附性及高穩(wěn)定性的新型碳結(jié)構(gòu)，分單壁碳納米管（SWCNT）和多壁碳納米管（MWCNT）兩類。碳納米管因其優(yōu)異的性能而成為眾多領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[5-6]。碳納米管用作電極材料可以加速物質(zhì)的電子交換[7]，因此成為電化學(xué)方法的新型材料。本文將多壁碳納米管修飾在玻碳電極上，研究維生素B2在該修飾電極上的電化學(xué)行為，發(fā)現(xiàn)該修飾電極對(duì)維生素B2產(chǎn)生明顯的電催化作用，從而建立一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏的直接測(cè)定維生素B2的電化學(xué)分析方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 主要儀器與試劑

CHI660A型電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司），采用三電極體系：多壁碳納米管修飾玻碳電極為工作電極，Ag/AgCl（飽和KCl溶液）電極為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極。

多壁碳納米管（MWCNT）由南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院生命分析化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，采用催化裂解的方法制備，并按文獻(xiàn)[8]方法進(jìn)行純化；雙十六烷基磷酸（DHP，瑞士Fluka公司）、維生素B2（生化試劑，上海試劑二廠）、維生素B2片(南京白敬宇制藥有限公司，規(guī)格5 mg)，所用化學(xué)試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

2.2 MWCNT修飾玻碳電極的制備

將5 mg MWCNT和5 mg DHP加入5 mL二次蒸餾水中，超聲分散20 min直至得到1 mg·mL-1淺黑色的MWCNT-DHP懸浮液。玻碳電極（有效直徑3 mm）依次用0.3、0.05 μm氧化鋁粉及麂皮拋光至鏡面，然后依次在無(wú)水乙醇和二次蒸餾水中超聲清洗3 min，紅外燈下烘干。用微量進(jìn)樣器取MWCNT-DHP懸浮液15 μL滴加在玻碳電極表面，紅外燈下?lián)]發(fā)掉溶劑即制得MWCNT修飾玻碳電極。

2.3 分析步驟

MWCNT修飾玻碳電極先在10 mL 0.1 mol·L-1鄰苯二甲酸氫鉀（pH：4.0）中經(jīng)循環(huán)伏安掃描活化（0.00～-0.80 V），直至循環(huán)伏安曲線穩(wěn)定為止。然后加入一定量的維生素B2標(biāo)準(zhǔn)溶液，通氮?dú)獬?0 min，在攪拌條件下開(kāi)路富集3 min后，靜止30 s，用線性掃描伏安法（LSV）進(jìn)行測(cè)定。每次測(cè)定后，電極在空白底液中于1.2 V恒電位電解900 s以除去吸附在表面的維生素B2，從而恢復(fù)其催化活性。所有實(shí)驗(yàn)均在室溫下進(jìn)行。

3 結(jié)果與討論

3.1 維生素B2在MWCNT修飾電極上的電化學(xué)行為

用循環(huán)伏安法研究1.0×10-5mol·L-1維生素B2在MWCNT修飾玻碳電極上的電化學(xué)行為，其循環(huán)伏安曲線如圖2所示。由圖可知，MWCNT修飾玻碳電極在鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液中未觀察到任何氧化還原峰（曲線a）。當(dāng)加入1.0×10-5mol·L-1維生素B2后，在0.00～－0.80 V的陰極掃描過(guò)程中，于－0.317 V出現(xiàn)一靈敏度高、峰形較好的還原峰；在反向掃描時(shí)，于－0.222 V出現(xiàn)一靈敏度高、峰形較好的氧化峰（曲線b）。而與之形成鮮明對(duì)比，維生素B2在裸玻碳電極上未觀察到明顯的氧化還原信號(hào)（圖未給出），這是因?yàn)镸WCNT具有獨(dú)特的電化學(xué)性質(zhì)和大比表面積，為維生素B2的氧化還原提供了很多的反應(yīng)位點(diǎn)，從而使電子交換變得容易，氧化還原峰電流顯著提高。由于維生素B2在MWCNT修飾玻碳電極上的還原峰比氧化峰更為靈敏，因此在接下來(lái)的研究中選擇還原峰來(lái)定量測(cè)定維生素B2。

隨著循環(huán)掃描次數(shù)的增加，維生素B2的氧化還原峰電流逐漸降低。當(dāng)以100 mV?s-1的掃速掃描3圈后，氧化還原峰電流趨于穩(wěn)定，說(shuō)明反應(yīng)物或者其反應(yīng)產(chǎn)物在修飾電極表面發(fā)生吸附，使電極表面有效的反應(yīng)位點(diǎn)降低，從而導(dǎo)致氧化還原峰電流降低。

圖2 MWCNT修飾玻碳電極在pH為4.0的鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液中的循環(huán)伏安曲線

3.2 測(cè)定底液的選擇

利用線性掃描伏安法研究1.0×10-5mol·L-1維生素B2在pH值為1.0的鹽酸溶液、pH值為4.0的鄰苯二甲酸氫鉀、pH值為9.2的硼砂溶液、pH值為6.0～8.0的磷酸鹽緩沖液以及pH值為4.0～6.0的醋酸—醋酸鈉緩沖液（濃度均為0.1 mol·L-1）中的電化學(xué)行為。結(jié)果表明：在0.1 mol·L-1鄰苯二甲酸氫鉀（pH：4.0）緩沖溶液中，維生素B2的還原峰峰形最好，峰電流最高，因而在實(shí)驗(yàn)中以此電解質(zhì)作為最佳測(cè)定底液。

圖3 1.0×10-5 mol·L-1維生素B2在MWCNT修飾玻碳電極上以不同時(shí)間的循環(huán)伏安曲線

3.3 修飾劑用量的影響

MWCNT膜能顯著提高維生素B2氧化還原峰電流。但實(shí)驗(yàn)表明，修飾電極表面的MWCNT-DHP復(fù)合膜的厚度（由滴加到玻碳電極表面的MWCNT-DHP懸浮液的用量決定）對(duì)維生素B2的氧化還原峰電流有很大的影響。當(dāng)懸浮液用量從0逐漸增加到10 μL時(shí)，氧化還原峰電流顯著增加，這是因?yàn)殡S著電極表面的MWCNT量的逐漸增加，維生素B2在電極表面的富集效率也相應(yīng)提高，對(duì)維生素B2氧化還原的催化活性也隨之增加，最終導(dǎo)致氧化還原峰電流也增加。當(dāng)用量進(jìn)一步增加時(shí)，氧化還原峰電流變化緩慢，但是當(dāng)用量超過(guò)20 μL時(shí)，氧化還原峰電流反而逐漸緩慢降低，這是因?yàn)榇藭r(shí)電極表面的DHP太多，膜的厚度增大，其絕緣效應(yīng)降低了MWCNT-DHP復(fù)合膜的導(dǎo)電性能，并阻礙了維生素B2的傳質(zhì)和與電極之間的電子交換，而且揮發(fā)溶劑也需要更長(zhǎng)的時(shí)間。所以本實(shí)驗(yàn)采用15 μL的1 mg·mL-1的MWCNT-DHP懸浮液來(lái)制備化學(xué)修飾電極。

3.4 富集電位和時(shí)間的影響

當(dāng)富集電位從0.40～－0.40 V時(shí)，氧化還原峰電流幾乎不變，這說(shuō)明富集電位對(duì)維生素B2在MWCNT修飾玻碳電極上的電化學(xué)氧化過(guò)程幾乎沒(méi)有影響，所以本實(shí)驗(yàn)選擇開(kāi)路富集。

在選定的富集電位下考察富集時(shí)間變化對(duì)維生素B2還原峰電流的影響。結(jié)果表明，在富集時(shí)間從0增加到3 min的過(guò)程中，還原峰電流幾乎線性增加；當(dāng)超過(guò)3 min時(shí)，峰電流增加緩慢，進(jìn)入平臺(tái)區(qū)，說(shuō)明此時(shí)維生素B2在修飾電極表面吸附達(dá)到飽和。本實(shí)驗(yàn)選用3 min的富集時(shí)間以提高分析靈敏度及縮短分析時(shí)間。

3.5 掃描速度的影響

如圖3所示，在100～300 mV·s-1的掃速范圍內(nèi)，1.0×10-5mol·L-1維生素B2的氧化還原峰電流與掃描速度存在良好的線性關(guān)系，這進(jìn)一步表明維生素B2在此修飾電極上的電極反應(yīng)是受吸附控制的。由于隨著掃描速度增大，充電電流必將增大，不利于峰電流的測(cè)定。為了獲得較好的信噪比，在獲得較大峰電流的同時(shí)又要防止充電電流過(guò)大，本實(shí)驗(yàn)最終選用100 mV·s-1的掃描速度。

3.6 線性范圍、檢出限及電極重現(xiàn)性

在上述優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下利用線性掃描伏安法研究維生素B2還原峰電流與濃度的關(guān)系。圖4中標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示維生素B2的還原峰電流ip（μA）與其濃度C（μmol·L-1）在3.0×10-6～2.0×10-5mol·L-1的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其回歸方程為：ip＝－0.652 9＋0.854 8C，（r＝0.999 0）。當(dāng)濃度高于2.0×10-4mol·L-1時(shí)，還原峰電流隨濃度增加而幾乎不變，進(jìn)一步說(shuō)明維生素B2在該修飾電極表面發(fā)生吸附。開(kāi)路富集3 min的檢出限為1.0×10-6mol·L-1（按3倍信噪比估算）。每次測(cè)定后，將吸附了維生素B2的修飾電極置于pH值為4.0的鄰苯二甲酸氫鉀緩沖溶液中，于1.2 V恒電位電解900 s后再用二次蒸餾水沖洗。清洗后的修飾電極，維生素B2的吸附峰消失，電極對(duì)維生素B2的電催化效果不變。更新的電極表面用于連續(xù)測(cè)定，在pH為4.0鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液中，對(duì)1.0×10-5mol·L-1的維生素B2平行測(cè)定10次的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為4.2%，說(shuō)明此修飾電極具有很好的重現(xiàn)性。但是如果將修飾電極在維生素B2溶液中長(zhǎng)時(shí)間掃描，維生素B2將在電極表面強(qiáng)烈吸附，且電極表面將生成一種聚核黃素膜[9]，這層膜的生成對(duì)電極的重現(xiàn)性將有影響。

此外還考察該修飾電極的使用壽命。將電極放置于空氣中72 h再測(cè)，峰電流并不顯著下降，表明電極暴露于空氣中亦可保持其催化活性。修飾電極每天測(cè)定1次，然后在空白底液中電解于1.2 V恒電位電解900 s活化后存放在冰箱中，4周后對(duì)1.0×10-5mol·L-1維生素B2的測(cè)定信號(hào)僅下降5.8%，這表明該修飾電極具有良好的穩(wěn)定性和較長(zhǎng)的使用壽命。

圖4 維生素B2在MWCNT修飾玻碳電極上的線性伏安曲線（內(nèi)插圖為標(biāo)準(zhǔn)曲線）

3.7 干擾實(shí)驗(yàn)

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，利用線性掃描伏安法研究一些常見(jiàn)的生物小分子及藥劑輔料對(duì)測(cè)定維生素B2的干擾。實(shí)驗(yàn)表明：500倍的葡萄糖、尿素，100倍的多巴胺、抗壞血酸、撲爾敏、茶堿、微晶纖維素、羧甲基淀粉鈉、硬脂酸鎂等，幾乎不干擾1.0×10-5mol·L-1維生素B2的測(cè)定（誤差＜3%），人體內(nèi)常見(jiàn)的各種金屬離子，如Na+、K+、Zn2+、Fe3+、Fe2+等，也不影響維生素B2的測(cè)定。

3.8 樣品分析

取市售維生素B2片（標(biāo)示含量為每片50 mg）10片，研細(xì)、稱量。準(zhǔn)確稱取相當(dāng)于1片藥片質(zhì)量的粉末樣品于100 mL棕色容量瓶中，加蒸餾水溶解并準(zhǔn)確定容，靜置12 h后取100 μL上層清液加入到9.9 mL鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液（pH：4.0）中稀釋待測(cè)。在選定的最佳條件下，利用線性掃描伏安法對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程計(jì)算出維生素B2含量，同時(shí)將該方法與藥典標(biāo)準(zhǔn)方法[1]進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。另外，在上述已知維生素B2含量的樣品溶液中，加入1.0×10-5mol·L-1的維生素B2標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述條件進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)回收率在95.8%～103.5%之間。結(jié)果表明，此方法測(cè)定結(jié)果與標(biāo)示量或藥典標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定結(jié)果均相符合，說(shuō)明該分析方法具有很高的準(zhǔn)確性，可用于實(shí)際樣品中維生素B2含量的測(cè)定。

表1 維生素B2片劑中含量（標(biāo)示量%）測(cè)定結(jié)果

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