逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的靶向人 Slingshot-1L基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細胞系的建立

張慕蕊 王 巖馬英智 趙東旭 楊旭芳 李玉林

(吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病理生物學(xué)教育部重點實驗室,吉林 長春 130021)

逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的靶向人 Slingshot-1L基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細胞系的建立

張慕蕊 王 巖1馬英智 趙東旭 楊旭芳 李玉林

(吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病理生物學(xué)教育部重點實驗室,吉林 長春 130021)

目的 建立過表達該基因的人骨髓間充質(zhì)干細胞(hMSCs)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系。方法 采用密度梯度離心法聯(lián)合貼壁培養(yǎng)法分離、純化 hMSCs。應(yīng)用脂質(zhì)體法將 Slingshot-1L重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 pLNCX-Slingshot-1L轉(zhuǎn)染 PA 317包裝細胞,G418篩選,滴度測定。收集病毒上清感染第 2代 hM SCs,G418篩選,挑選陽性克隆,擴增培養(yǎng)。結(jié)果 采用密度梯度離心法聯(lián)合貼壁培養(yǎng)法成功分離、純化了 hMSCs,應(yīng)用 pLNCX-Slingshot-1L重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染 PA 317包裝細胞,獲得滴度為 5×108CFU/L的病毒上清。收集病毒上清感染 hMSCs,獲得了過表達 Slingshot-1L基因的hMSCs。結(jié)論 應(yīng)用 Slingshot-1L重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,成功建立了過表達該基因的 hMSCs穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系。

逆轉(zhuǎn)錄病毒;穩(wěn)定轉(zhuǎn)染;干細胞

干細胞是一類具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細胞群體,有望成為移植器官的新來源,然而對其向不同方向分化的機制尚不明了。研究表明,機械應(yīng)力刺激可引起骨髓間充質(zhì)干細胞(M SCs)和成骨細胞骨架的解聚和重排,而且M SCs對機械力刺激的反應(yīng)比成骨細胞更敏感〔1〕,表明細胞骨架在M SCs分化過程中可能發(fā)揮了重要作用。Slingshot(SSH)是一種特異的肌動蛋白解聚因子 (Cofilin)磷酸酶,可使 Cofilin去磷酸化而活化,抑制肌動蛋白絲聚合,參與對細胞骨架的重排〔2〕,表明 SSH t在干細胞分化過程中可能發(fā)揮重要作用。目前國內(nèi)外對 SSH研究剛剛起步。本文應(yīng)用 SSH-1L重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,獲得高滴度病毒上清,建立過表達該基因 hM SCs穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系,為研究M SCs分化相關(guān)機制提供有力實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 標本來源 18～45歲正常成人穿刺骨髓血 5例,均來自健康自愿者。

1.2 主要試劑和儀器 PA 317及N IH3T3細胞為本實驗室保存。重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 pLNCX-SSH-1L由王巖教授惠贈(SSH-1L基因全長插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 pLNCXMCS多克隆位點,末端含有 c-m yc tag)。高糖DM EM培養(yǎng)基、低糖DM EM培養(yǎng)基(美國 Gibco公司),胎牛血清(Hyc lone公司),胰蛋白酶和EDTA(Sigm a公司),Perco ll分離液 (美國 Pharm ia公司); CD 105、CD 73、CD 166、CD 29、CD 45抗體 (BDPharM ingen公司或NeoM arker公司),FITC標記二抗 (Sigm a公司),抗人 c-m yc tag抗體 (博奧森生物工程有限公司),抗人 P-cofilin抗體和抗人Cofilin抗體 (美國 Santa Cruz公司 )。引物 hSSH-1L前向:CACAAGCATGCAGGTGATCT,反向:TATGTGCATCCTTCCTGCTG (306 bp);GAPDH前向:GCATCCTCACCCTGAAGTAC,反向: TGGTGCCGCCAGACAGCACT(750 bp)(上海生工合成)。

1.3 hM SCs的分離培養(yǎng) 具體方法見文獻〔3〕,以 P2和 P4代hM SCs為實驗對象。

1.4 病毒包裝及陽性克隆篩選 將 PA 317細胞接種于 6孔板中,至細胞長滿約 80%時應(yīng)用脂質(zhì)體法將 pLNCX-SSH-1L重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入 PA 317細胞,參考 Invitrogen公司試劑盒說明書操作。轉(zhuǎn)染 48 h后傳代,用含 800m g/L G418和 10%胎牛血清的 HDM EM培養(yǎng)基篩選。10 d后可見陽性克隆,挑選克隆,繼續(xù)培養(yǎng),待細胞接近完全融合時移取上清,即含有病毒的培養(yǎng)液。以未轉(zhuǎn)染的 PA 317細胞作對照。

1.5 病毒滴度測定與計算 將N IH 3T3細胞接種于6孔板,收集病毒液,過濾,制備 6個系列稀釋梯度的病毒液,加入 6孔板,Polybrene終濃度為 8μg/m l。病毒感染 24 h后,用含500μg/m l G418培養(yǎng)液篩選 1 w。病毒滴度 =最高稀釋度所形成的克隆數(shù) ×稀釋因子。

1.6 建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系 將第 2代的 hM SCs接種于 6孔板,從包裝細胞 PA 317收集的病毒液,過濾后,將病毒液加至hM SCs,間隔 24 h后再次感染病毒,Polybrene的終濃度為8μg/m l。24 h后更換含 300μg/m lG418培養(yǎng)液篩選,2w后獲得陽性克隆。隨機挑選陽性克隆擴增培養(yǎng),G418濃度降為150μg/m l。

1.7 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系的鑒定

1.7.1 應(yīng)用抗人 c-m yc tag抗體對轉(zhuǎn)染后的細胞進行免疫熒光測定 轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的 hM SCs細胞鋪細胞爬片,4%多聚甲醛固定,血清封閉,加一抗 (抗人 c-m yc tag抗體),4℃孵育過夜,加 FITC標記的二抗,避光孵育 30m in,PI染核。胞漿中出現(xiàn)綠色熒光為陽性反應(yīng)。

1.7.2 應(yīng)用 RT-PCR檢測 SSH-1L的表達情況 提取轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染 hM SCs細胞的總 RNA,測定純度及含量,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,應(yīng)用 SSH-1L和 GAPDH引物進行 PCR擴增。反應(yīng)結(jié)束后,分別取 PCR產(chǎn)物 5μl,瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下觀察。

1.7.3 W estern印跡檢測 Cofilin和 P-cofilin的表達情況 提取轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染 hM SCs細胞,裂解后取上清加入凝膠加樣緩沖液,沸水浴上加熱 5m in,上樣,電泳、轉(zhuǎn)膜、雜交、ECL顯色。

2 結(jié) 果

2.1 hM SCs形態(tài)學(xué)特點及表面標志鑒定 聯(lián)合應(yīng)用 Perco ll (1.073 g/m l)密度梯度離心法和貼壁篩選法,成功分離出 hMSCs。細胞均為紡錘狀,呈成纖維細胞樣,匯流時呈魚群樣或漩渦狀排列。流式細胞儀檢測 P4 hM SCs表面標志表達情況, CD 29、CD 73、CD105(間充質(zhì)干細胞相對特異性標志)和 CD 166 (間充質(zhì)細胞標志)為陽性,CD 45(白細胞標志)陰性。細胞成分均一,純度在 96%以上,具有高度的同源性。

2.2 pLNCX-SSH-1L轉(zhuǎn)染包裝細胞 PA 317 PA 317細胞經(jīng)轉(zhuǎn)染后,第 5天可見大批細胞死亡,第 7天陰性對照組全部死亡,第 10天實驗組出現(xiàn)由數(shù)個細胞組成的陽性克隆,2 w左右陽性克隆接近融合。

2.3 病毒液的產(chǎn)生及病毒滴度的測定 待陽性克隆接近融合,收集 PA 317細胞的病毒上清,過濾后,用 N IH3T3細胞測定病毒滴度。病毒感染 N IH3T3細胞 24 h后,用含500μg/m l G418培養(yǎng)液篩選 1w,經(jīng)測定病毒滴度為 5×108cfu/L。

2.4 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系的建立 收集病毒上清,過濾后,感染hM SCs。經(jīng) 300μg/m lG418培養(yǎng)液篩選 2w后,獲得 15個陽性細胞克隆,隨機挑選 5個陽性克隆擴增培養(yǎng),G418濃度降至150μg/m l。

2.5 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系的鑒定 由于載體上攜帶 c-m yc標記,因此用 c-m yc tag抗體對轉(zhuǎn)染后的細胞進行免疫熒光測定,結(jié)果顯示 hM SCs感染率為 90%以上(圖 1)。應(yīng)用 RT-PCR檢測SSH-1L的表達情況,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組較未轉(zhuǎn)染組 SSH-1L的表達明顯增強(圖 2)。W estern印跡結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組較未轉(zhuǎn)染組P-cofilin的表達明顯減少 (圖 3),證實穩(wěn)定轉(zhuǎn)染成功。

圖 1 免疫熒光檢測 hM SC s的感染率(×400)

圖2 RT-PCR檢測SSH-1L的表達情況

圖3 W estern印跡檢測結(jié)果

3 討 論

干細胞依分化潛能的大小大致可分為 3種類型〔4,5〕:①全能干細胞;②多能干細胞;③專能干細胞。而間充質(zhì)干細胞(M SCs)則屬于多能干細胞,由于其具有取材容易、擴增能力強、具有高度的分化潛能、無免疫排斥及倫理道德等限制、易于外源基因的轉(zhuǎn)染和表達等無可比擬的優(yōu)勢在組織工程學(xué)中被廣泛應(yīng)用,成為細胞治療和基因治療的理想靶細胞〔6,7〕。

由于骨髓中M SCs數(shù)量少,因此對M SCs進行有效的體外分離培養(yǎng)擴增是后續(xù)工作的關(guān)鍵〔3〕。目前國內(nèi)外常用的分離劑有 Perco ll和 Fico ll兩種。選用 Perco ll分離液 (1.073 g),即使有少量成纖維細胞污染,因其是成熟細胞不能多次傳代,因此可隨著傳代而逐漸消失,從而獲得的M SCs具有高度同源性〔8〕。本文即應(yīng)用了 Perco ll密度梯度離心法聯(lián)合貼壁篩選法獲得了高度同源性的M SCs,純度可達 96%以上。

此外,M SCs在不同的誘導(dǎo)條件下可分化為多種組織細胞〔9〕。然而對其向不同方向分化的機制尚不明了。研究表明,機械應(yīng)力刺激可引起M SCs和成骨細胞骨架解聚和重排,而且M SCs對機械力刺激的反應(yīng)比成骨細胞更敏感,表明細胞骨架在M SCs分化過程中可能發(fā)揮了重要作用。SSH可使 Cofilin去磷酸化,同時激活 Cofilin,進而促進肌動蛋白絲的解聚,抑制肌動蛋白絲聚合,因而參與對細胞骨架的重排〔10,11〕。

本實驗即應(yīng)用 SSH-1L重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,獲得高滴度的病毒上清,建立過表達該基因的 hM SCs穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系,為研究 SSH對M SCs分化的影響奠定了實驗基礎(chǔ)。

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〔2009-10-15收稿 2009-09-11修回〕

(編輯 曲 莉)

Estab lishm en t of stab le tran sfected hum an m arrow m esen chym a l stem cell line Slingsho t-1L m ed ia ted by retrov ira l

ZHANGM u-Ru i,W ANG Yan,M A Y ing-Zh i,et a l.

O b jective To estab lish stab le transfected hum anmarrow m esenchym al stem cells(hM SCs)line by retroviral vector encoding Slingshot-1L to abtain viral supernatantw ith high viral titers.M ethods hMSCswere isolated and purified from the bonemarrow of hum an by density gradient centrifugation and adhering to the cu lture dishes.The p lasm id pLNCX-Slingshot-1L was transfected into packaging cell PA 317 by lipofectam ine.The transfectantswere selected by G418 and viral titerswere analyzed.V irals supernatantw ere co llected to infect hM SCs in the second passage,selected by G418.Resu lts V irals supernatantw ith high viral titerswereobtained by retroviralvectorencod ing Slingsho t-1L,virals supernatantwere co llected to infect hM SCs,and stable transfected hM SCs linewas estab lished.Con c lusion s The stab le transfected hM SCs line over exp ress Slingsho t-1L m ed iated by retroviralwas estab lished successfu lly.

Retrovirus vector;Stab le transfected cell line;Stem cells

book=330,ebook=21

Q782

A

1005-9202(2010)03-0330-03

國家863重大專項(2004AA 205020);國家自然科學(xué)基金資助項目;吉林省科技廳重大項目(20076023)

1 吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院臨床基因診療中心

李玉林(1950-),男,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事干細胞組織工程方面的相關(guān)研究。

張慕蕊 (1981-),女,在讀博士,主要從事細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的相關(guān)研究。

Key Labora tory of Pa thob io logy,M in istry of Educa tion,Schoo l of BasicM ed ica l Sc iences,Jilin Un iversity,Changchun 130021, Jilin,Ch ina