菌糠酶提取與制備方法研究

劉瑩瑩，張 堅(jiān)，王紅兵，肖兵南

（1.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南長(zhǎng)沙410131；2.湖南光大牧業(yè)科技有限公司，湖南長(zhǎng)沙410131）

要從菌糠中獲得干酶制劑，必須經(jīng)過提取、濃縮、干燥等過程。筆者從4種不同的提取方法中選擇酶提取率最高的方法，然后比較3種不同的濃縮方法，擬從中選擇較優(yōu)的一種，最后采用真空干燥的方法來獲得干酶制劑。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)試材為香菇菌糠，從湖南省春華食用菌有限公司獲得。透析袋的截留分子量為12 000，產(chǎn)自聯(lián)合碳化物公司。

試劑：硫酸銨，無水乙醇，2%碳酸氫鈉，1 mmol/L EDTA，氫氧化鈉，pH 4.8、0.05 mol/L檸檬酸緩沖液。

主要儀器：真空干燥箱，紫外可見分光光度計(jì)，電熱鼓風(fēng)箱，自動(dòng)純水蒸餾器，電子分析天平，電熱恒溫水浴鍋，勻漿機(jī)，臺(tái)式冷凍離心機(jī)，酸度計(jì)，移液槍，離心管。

1.2 方法

1.2.1 粗酶提取方法的篩選[1]取自然干燥的菌糠加10倍蒸餾水，置于勻漿機(jī)中充分打碎，然后采取4種不同的處理：（1）在40℃恒溫水浴中浸提45 min；（2）在 40℃恒溫水浴中浸提 90 min；（3）在室溫（10℃）下浸提 90 min；（4）在室溫（10℃）下浸提12 h。各浸提液經(jīng)多層紗布過濾，濾液以3 000 r/min離心5 min，得上層清液即為粗酶液。各粗酶液用緩沖液稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，測(cè)定纖維素酶活（CMC酶活）。

1.2.2 3種方法濃縮粗酶液的比較 （1）乙醇沉淀法：取粗酶液50 mL，緩慢加入無水乙醇并不停地?cái)嚢?，直至產(chǎn)生混濁，4℃靜置過夜，4 000 r/min離心15 min，收集上清液和沉淀，并用1 mL蒸餾水溶解沉淀，分別測(cè)定上清液和沉淀物中的CMC酶活；（2）硫酸銨沉淀法：取粗酶液50 mL，加固體硫酸銨至30%飽和度，4℃靜置過夜，4 000 r/min離心15 min，收集上清液和沉淀，并用1 mL蒸餾水溶解沉淀，分別測(cè)定上清液和沉淀物中的CMC酶活；（3）中空纖維膜過濾法：取粗酶液5 000 mL，選用中空纖維超濾小型試驗(yàn)裝置，在0.1 MPa下，首先經(jīng)截留分子量分別為100k的膜過濾，收集流出液，再經(jīng)過截留分子量分別為3k的膜過濾濃縮至100 mL，取樣測(cè)定CMC酶活和木聚糖酶酶活。

1.2.3 對(duì)沉淀物的透析 透析袋的準(zhǔn)備[2]：將透析袋剪成合適長(zhǎng)度，約15 cm。在250 mL燒杯中加入大量的2%碳酸氫鈉和1 mmol/L EDTA。將透析袋放入其中，煮沸10 min。用蒸餾水徹底洗滌，然后在蒸餾水中煮10 min。冷卻后4℃存放，在貯存過程中透析管應(yīng)完全浸于水中。使用前用蒸餾水清洗透析管內(nèi)外，操作時(shí)用鑷子或戴手套。

使用時(shí)，一端用細(xì)繩扎緊，由另一端灌水，用手指稍加壓，檢查不漏方可裝入待透析液，通常要留1/3至1/2的空間，以防透析過程中，透析的小分子量較大時(shí)，袋外的水和緩沖液過量進(jìn)入袋內(nèi)將袋漲破。

1.2.4 酶液的透析 向1 L粗酶液中加入固體硫酸銨至80%飽和度，4℃放置過夜，4 000 r/min離心20 min，收集沉淀，用少量蒸餾水溶解，裝入透析袋中，置于4℃冰箱中，用pH4.8、0.05 mol/L檸檬酸緩沖液充分透析，每隔3 h更換一次透析液，透析12 h，得到除鹽的酶液，分別測(cè)定酶液中的CMC酶活和木聚糖酶酶活。

1.2.5 酶液的干燥 將透析后的酶液放入真空干燥箱中，40℃恒溫干燥，干燥物磨粉后即得到干酶制劑，分別測(cè)定其中的CMC酶活和木聚糖酶酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗酶提取方法的篩選結(jié)果

酶是生物活性物質(zhì)，其提取過程受多種因素如溫度、時(shí)間、溶劑種類等的影響。為了最大限度的提取酶活，盡可能減少各種因素引起的酶活損失，故應(yīng)選擇最合適的條件。把最高酶活定為100%，測(cè)定結(jié)果見表1。結(jié)果表明，在室溫（10℃）下用蒸餾水浸提12 h，所得的粗酶液的相對(duì)酶活最高，也就是說酶的提取率最高，因此該提取方法最佳。

表1 提取方法對(duì)纖維素酶提取率的影響

2.2 3種方法濃縮粗酶液的比較

3 種濃縮方法濃縮粗酶液的結(jié)果見表2，從表2可以看出，粗酶液經(jīng)硫酸銨沉淀后，上清液和沉淀物的CMC酶活均明顯高于乙醇沉淀法對(duì)應(yīng)的酶活，說明硫酸銨沉淀法優(yōu)于乙醇沉淀法。中空纖維膜超濾法所得清澈棄去液的酶活最低，而沉淀物的酶活最高，表明此法最優(yōu)?？赡苡捎谝掖紝?duì)酶的活性有影響而影響酶活力大小，硫酸銨沉淀后必須將沉淀透析去鹽，工藝復(fù)雜。膜過濾法方法簡(jiǎn)單、效果好、一步到位。

表2 濃縮方法對(duì)纖維素酶酶活的影響(IU/g)

2.3 對(duì)沉淀物透析的結(jié)果

粗酶液經(jīng)硫酸銨沉淀，離心，收集的沉淀物中含有大量的硫酸銨，因此必須將硫酸銨除去。按照1.2.3的方法，得到除鹽的酶液，其CMC酶活和木聚糖酶酶活見表3。

表3 透析后酶液中酶活的測(cè)定結(jié)果 （IU/g）

2.4 酶液的干燥

按照1.2.5的方法，制得干酶制劑，其CMC酶活和木聚糖酶酶活見表4。結(jié)果表明，50 g干酶制劑中纖維素酶總酶活達(dá)8 021 IU，木聚糖酶總酶活達(dá)14 483 IU。

表4 干酶制劑中酶活的測(cè)定結(jié)果 （IU）

3 討論

3.1 酶的提取方法對(duì)酶提取率的影響

許堯興[3]報(bào)道，酶粉用蒸餾水浸提，40℃水浴浸泡30 min，酶粉中酸性蛋白酶提取最完全。也有資料報(bào)道，酶粉采用與測(cè)定底物相同pH的緩沖液浸提，酶提取最完全。由于本試驗(yàn)是從菌糠中提取酶，情況有所不同，在室溫（10℃）下用蒸餾水浸提12 h，酶提取最完全。

3.2 關(guān)于酶的濃縮、干燥

從香菇菌糠中提取的酶液，經(jīng)膜過濾法濃縮，沉淀物中纖維素酶酶活最高，達(dá)187.8 IU/g，膜過濾法方法簡(jiǎn)單、效果好、一步到位。粗酶液經(jīng)硫酸銨沉淀，然后透析除鹽，再經(jīng)真空干燥，制得干酶制劑，其中纖維素酶總酶活達(dá)8 021 IU，木聚糖酶總酶活達(dá)14 483 IU，可見其酶活非常高。同時(shí)還可以完善生產(chǎn)工藝，如采用冷凍干燥，可進(jìn)一步提高酶活。由此來看，香菇菌糠具有開發(fā)飼用酶制劑的潛在價(jià)值。

目前，我國(guó)還有大量菌糠沒有被合理利用而浪費(fèi)，本研究以菌糠為原料來開發(fā)飼用酶，變廢為寶，無疑可以降低生產(chǎn)飼用酶的成本，提高經(jīng)濟(jì)效益，但生產(chǎn)工藝需進(jìn)一步完善。

[1]陸文濤.固態(tài)發(fā)酵飼料用纖維素酶活力的測(cè)定分析[J].飼料研究，2001，（12）：3-5.

[2]諸葛健，王正祥.工業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊(cè)[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，1994.155-279.

[3]許堯興，許少春，姚曉紅.不同測(cè)定程序?qū)︼曈盟嵝缘鞍酌笝z測(cè)的影響[J].中國(guó)飼料，2001（14）：26-28.