青島文昌魚(yú)促甲狀腺激素受體(TSHR)蛋白的融合表達(dá)及鑒定

董 娟,辛 明,趙博生

(山東理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東 淄博 255049)

促甲狀腺激素受體(the thyrotropin receptor,TSHR)屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族[1].它與促甲狀腺激素特異性結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)甲狀腺細(xì)胞的成長(zhǎng)、增殖和分化[2],通過(guò)第二信使cAMP[3],激活磷脂酶C和蛋白激酶A信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng).近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)TSHR除在甲狀腺細(xì)胞中表達(dá)外,還在淋巴細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌纖維細(xì)胞表面及生殖腺等[4-5]組織細(xì)胞有表達(dá).TSHR胞外域突變,可引發(fā)AITD疾病[6-7].文昌魚(yú)屬于脊索動(dòng)物門(mén)頭索亞門(mén),處在無(wú)脊椎動(dòng)物向脊椎動(dòng)物進(jìn)化的關(guān)鍵位置,是研究脊索動(dòng)物演化和胚胎發(fā)育的模式動(dòng)物,在比較基因組學(xué)和發(fā)育同源性研究中有重要作用[8].關(guān)于文昌魚(yú)內(nèi)柱和脊椎動(dòng)物甲狀腺之間的同源性獲得了多方面證據(jù)支持:內(nèi)柱可以同甲狀腺一樣代謝碘產(chǎn)生的碘化甲狀腺氨酸,而且能合成相似的甲狀腺球蛋白和過(guò)氧化物酶等[9].

本文通過(guò)構(gòu)建文昌魚(yú)TSHR基因的原核表達(dá)載體,得到融合表達(dá)蛋白,為以后研究該蛋白的性質(zhì)、功能、與其相互作用蛋白以及脊椎動(dòng)物甲狀腺的起源問(wèn)題提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

重組質(zhì)粒pcDNA3-TSH R為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建;pGEX-4T-1載體購(gòu)自Promega公司;E.coliDH5α為實(shí)驗(yàn)室保存菌種;T aq聚合酶、BamHI、XhoI、DNA回收純化試劑盒、蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等均購(gòu)自TAKARA公司;兔抗人促甲狀腺激素受體蛋白購(gòu)自北京賽馳生物科技有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 pGEX-4T-1-TSHR重組質(zhì)粒表達(dá)體系的構(gòu)建

根據(jù)青島文昌魚(yú)TSHR基因,設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的特異性引物,由上海生工生物技術(shù)公司合成.上游引物序列5'CGGGATCCTGCTGCT TACC 3'(下劃線表示BamHI酶切位點(diǎn)),下游引物序列5'CCCTCGAGGGTCAAGTGAACCAGTC 3'(下劃線表示XhoI酶切位點(diǎn)).以pcDNA3-TSHR質(zhì)粒為模板,加入合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增.用BamHI和XhoI分別對(duì)PCR得到的TSHR基因片段與pGEX-4T-1載體進(jìn)行雙酶切,將酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳后,用TAKARA公司DNA回收試劑盒分別回收,T4連接酶16℃連接過(guò)夜.連接產(chǎn)物5μ L轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌DH5α.將轉(zhuǎn)化后的DH5α涂布于含100 μ g/mL Amp+的LB平板,37℃培養(yǎng)16 h,挑取菌落,提取重組質(zhì)粒,用TSHR基因的特異性引物進(jìn)行PCR鑒定.并使用BamHI和XhoI進(jìn)行雙酶切鑒定,將鑒定正確的質(zhì)粒送上海博尚生物公司測(cè)序,陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為pGEX-4T-1-TSHR.

1.2.2 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-TSH R的誘導(dǎo)表達(dá)

含重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-TSHR的大腸桿菌DH5α過(guò)夜培養(yǎng),以此為種子菌接種在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中,37℃,250 r/min振蕩培養(yǎng)至A600接近0.6時(shí),加入1mmol/L IPTG,并在誘導(dǎo)2h、3h、4h、5h時(shí)收集菌液1mL,離心收集細(xì)菌沉淀,用轉(zhuǎn)化pGEX-4T-1載體的DH5α和未轉(zhuǎn)化載體的DH5α作為對(duì)照,進(jìn)行SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)分析.

1.2.3 Western blot分析

12%的SDS-PAGE凝膠電泳后,轉(zhuǎn)PVDF膜,5%的BSA在37℃封閉2h;PBST室溫洗膜,加入兔抗TSH R多克隆抗體(1:300),于4℃孵育過(guò)夜;PBST室溫洗膜,加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1:1000)37℃1 h,PBST室溫洗膜,加底物DAB顯色.

2 結(jié)果

2.1 TSHR基因的PCR擴(kuò)增及重組質(zhì)粒鑒定

用PCR基因擴(kuò)增法得到含有BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)的TSHR基因片段,結(jié)果為一條1700 bp左右的條帶,與目的基因大小相符(圖1).通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)化后篩選得到菌株,提取重組質(zhì)粒,進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到一條與目的基因的大小一致,約1700 bp大小的條帶(圖2);雙酶切鑒定得到兩條分別為1700 bp和4900 bp的條帶(圖2),分別與目的基因和線性化質(zhì)粒pGEX-4T-1的大小相一致.并且測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行blast比對(duì),發(fā)現(xiàn)序列完整正確.說(shuō)明目的基因片斷已成功連接到表達(dá)載體上,表達(dá)載體構(gòu)建成功.

圖1 PCR得到含有BamHI and XhoI酶切位點(diǎn)的T SHR基因片段

2.2 重組蛋白的表達(dá)及鑒定

含有重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-TSHR的工程菌經(jīng)1mmol/L IPTG誘導(dǎo)后,經(jīng)SDS-PAGE分析,在76 kDa處有一條條帶,而對(duì)照空載體和空菌的誘導(dǎo)在此位置沒(méi)有條帶(圖3).根據(jù)DNASTAR軟件模擬分析得出TSHR蛋白分子量約50 kDa,而GST大小約為26kDa,與SDS-PAGE分析的大小一致.說(shuō)明在大腸桿菌DH5α中表達(dá)了融合蛋白.Western blot證實(shí),表達(dá)蛋白即為目的蛋白(圖4).

圖2 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-TSHR的酶切鑒定及PCR鑒定

圖3 重組蛋白表達(dá)的SDS-PAGE分析

圖4 Western blot檢測(cè)目的基因表達(dá)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)將PCR擴(kuò)增得到的TSHR基因片段,連接到pGEX-4T-1,轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5α中,構(gòu)建了青島文昌魚(yú)pGEX-4T-1-TSHR融合表達(dá)載體.重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR、雙酶切及測(cè)序檢測(cè),表明青島文昌魚(yú)TSHR基因準(zhǔn)確插入pGEX-4T-1表達(dá)載體中.以時(shí)間為梯度,1mM IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌的表達(dá),發(fā)現(xiàn)4 h,5 h時(shí)表達(dá)量比較多.但是因?yàn)榇说鞍资悄さ鞍锥沂羌に仡?lèi)受體,所以總體來(lái)說(shuō)表達(dá)量不是很大.用抗促甲狀腺激素受體多克隆抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè),結(jié)果顯示表達(dá)蛋白是TSHR蛋白.

促甲狀腺激素受體在脊椎動(dòng)物下丘腦—垂體—甲狀腺調(diào)控軸中發(fā)揮著重要作用,被認(rèn)為是甲狀腺的一個(gè)特殊的蛋白.它的突變能引起一些重要的疾病,如甲狀腺功能低下、甲狀腺瘤、Graves眼病等.目前在脊椎動(dòng)物中對(duì)其研究主要集中在疾病研究中.一些研究表明文昌魚(yú)內(nèi)柱和脊椎動(dòng)物甲狀腺具有同源性.

本實(shí)驗(yàn)成功表達(dá)了該蛋白,為后續(xù)研究該蛋白結(jié)構(gòu)和生物功能,以及與其相互作用蛋白的研究奠定了基礎(chǔ),同時(shí),鑒于文昌魚(yú)的特殊進(jìn)化地位,對(duì)于闡釋TSH R蛋白的起源與進(jìn)化,以及進(jìn)一步探索其具體的分子機(jī)理都具有重要的理論和實(shí)踐意義.

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