內皮細胞與小腸黏膜下層細胞相容性的初步研究

孫慶蘭，張 華，張西正，郭 勇，李瑞欣，戰(zhàn) 銳

（1.天津工業(yè)大學 理學院，天津 300160；2.軍事醫(yī)學科學院 衛(wèi)生裝備研究所，天津 300161；3.軍事醫(yī)學科學院 衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所，天津 300050）

內皮細胞與小腸黏膜下層細胞相容性的初步研究

孫慶蘭1，張 華1，張西正2，郭 勇2，李瑞欣2，戰(zhàn) 銳3

（1.天津工業(yè)大學 理學院，天津 300160；2.軍事醫(yī)學科學院 衛(wèi)生裝備研究所，天津 300161；3.軍事醫(yī)學科學院 衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所，天津 300050）

通過鹽溶液溶脹和酶液消化制備小腸黏膜下層基質作為血管組織工程支架材料，將大鼠內皮細胞接種于支架材料上，測定小腸黏膜下層基質的細胞相容性.實驗結果表明：內皮細胞在小腸黏膜下層基質上迅速鋪展增殖生長，在4 h時大約有96%的細胞黏附于材料上，MTT法結果表明內皮細胞在支架上增殖生長明顯，活細胞形態(tài)學觀察表明細胞在支架材料上生長良好.

小腸黏膜下層；支架；內皮細胞；組織工程

目前對血管移植物的需求不斷增大，組織工程方法可以較好地解決此問題[1].支架材料作為活細胞在體外生長時的支持物，在組織工程中占據(jù)很重要的位置.組織工程血管支架材料應具有良好的生物相容性，不易形成血栓等[2].30多年前有學者提出把小腸黏膜下層基質（Small intestinal submucosa，SIS）作為血管支架材料[3].小腸黏膜下層是一種優(yōu)良的天然生物材料，來源廣泛，并且還具有良好的力學性能[4].雖然很多研究者都把SIS作為良好的組織工程血管材料，但是血管種子細胞和SIS的復合情況卻少有研究.本文采用處理過的SIS做支架，再種植血管內皮細胞，測定細胞與材料的復合情況，并作相關的形態(tài)學觀察，可以為組織工程血管研究的發(fā)展提供有價值的實驗資料.

1 實驗部分

1.1 主要材料和設備

試驗動物采用清潔級Wistar大鼠，雌雄不拘，體重150～180 g，中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供.

所用試劑包括：DMEM培養(yǎng)液，美國GIBCO公司產(chǎn)品；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品；胰蛋白液，美國GIBCO公司產(chǎn)品；凝血Ⅷ因子相關抗原免疫組織化學檢測試劑盒，武漢博士德公司產(chǎn)品；MTT，聯(lián)星生物公司產(chǎn)品.

所用儀器包括：超凈臺，蘇州凈化設備公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡，日本Olympus產(chǎn)品；5%CO2培養(yǎng)箱，美國Forma公司產(chǎn)品.

1.2 內皮細胞培養(yǎng)

斷頸法處死Wistar大鼠，無菌條件下快速取出胸段主動脈放置于盛有D-hank′s的培養(yǎng)皿中；用鑷子去掉血管表面結締組織和脂肪組織，將血管縱行剖開，用剪刀將血管剪成1 mm3左右，將血管內膜面貼于鼠尾膠原包被好的培養(yǎng)瓶內[5]；加入2～3 mL含20%FBS的DMEM培養(yǎng)液，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；翻轉干涸3～4 h后，輕輕翻轉平放，靜置培養(yǎng).6～7 d左右時去除組織塊并換液培養(yǎng)，以后每隔3 d換液1次.當細胞達到80%融合時，用0.25%胰蛋白酶進行消化，以1∶2或1∶3的比例傳代，以獲得足夠量的種子細胞.取3～8代細胞進行實驗.

1.3 SIS制備

將新鮮的豬小腸用清水反復沖洗后，用裹有紗布的刀柄去除外面的漿膜層和肌層，翻轉后，去除黏膜層.經(jīng)50 mmol/L EDTA和10 mmol/L NaOH處理16 h后，再用去離子水沖洗干凈.再經(jīng)1 mmol/L NaCl和1 mmol/L HCl處理8 h[6]，去離子水反復沖洗.1 mmol/L NaCl磷酸緩沖液處理16 h.0.25%胰酶和0.5%SDS分別處理24 h，去離子水沖洗.PBS浸洗6～8 h，0.3% H2O2浸泡6～8 h，去離子水浸洗4～6 h，凍干，置于-20℃溫度下保存.

1.4 內皮細胞與SIS材料表面黏附情況測定

將處理過的小腸黏膜下層處理成24孔板大小，鋪于孔板內，經(jīng)紫外線照射滅菌后待用.將大鼠內皮細胞消化成2.5×105個/mL，吸取100 μL加入各孔，分別在種植細胞1、2、4 h時，加入900 μL D-hank′s，輕輕吹打后取上清液用血球計數(shù)板進行計數(shù)，進而得到細胞貼壁數(shù)目.

1.5 MTT法測定內皮細胞在SIS上的增殖情況

將處理過的小腸黏膜下層（SIS）處理成24孔板大小，并將其平整鋪于孔板內，經(jīng)紫外線照射滅菌后待用.將大鼠內皮細胞消化成4.5×105個/mL的細胞懸液，接種于24孔板內，每孔接種200 μL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng).于第1、3、5、7 d各取出1塊培養(yǎng)板，將接種有內皮細胞的材料取出放入空白板內，沿側壁緩緩加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液400 μL；然后加入100 μL的MTT（2 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h；然后小心吸出孔內液體，每孔加入450 μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min；將液體吸出，按每孔150 μL加入到96孔板內，用酶標儀在490 nm處測定OD值.

2 結果與討論

2.1 SIS觀察

經(jīng)過鹽溶液溶脹和酶液消化法、PBS振蕩洗滌等步驟后制備成脫細胞小腸黏膜下層基質.支架材料行HE染色，見圖1（a），觀察得到支架材料脫細胞完全，無細胞或細胞碎片殘留，而圖1中（b）觀察得到SIS膠原保存良好.

圖1 小腸黏膜下層（SIS）光學顯微鏡照片F(xiàn)ig.1 Optical microscope image of small intestinal submucosa

2.2 內皮細胞與SIS材料表面黏附情況測定

雖然種子細胞的種植有多種方法，但是由于內皮細胞是單層生長細胞，并且存在小腸黏膜下層基質在溶液較多的情況下會漂浮起來等原因，為了保證細胞能夠最大程度地黏附于材料上，采用細胞計數(shù)的方法測定了細胞與支架材料黏附的最佳時間，測定結果如表1所示.

表1 內皮細胞與SIS粘附率測定Tab.1 Rate of adhesion about ECs and SIS

由表1可見，內皮細胞在1 h時貼壁數(shù)目就很多，達到了2.0×104個（共2.5×104個/孔），可見內皮細胞在短時間內就能很好地貼壁.在2 h和4 h時貼壁細胞數(shù)目都有相應的增加，4 h時細胞黏附率達到96%左右.若在此時再補加培養(yǎng)液，細胞不會因為浮力的作用而漂浮于培養(yǎng)液中，以致于難以貼壁生長.

2.3 MTT法測定內皮細胞在SIS上的增殖

由于細胞計數(shù)法誤差很大，而通過MTT法測定細胞增殖情況，是目前為止使用較廣和比較可靠的方法之一.活細胞中的線粒體脫氫酶能將染料MTT轉變?yōu)椴豢扇苄缘淖仙篆戭w粒，二甲基亞砜可溶解甲瓚顆粒，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量.而在一定細胞數(shù)范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數(shù)成正比.圖2所示分別為在第1、3、5、7 d時，以9×104/24孔板的密度種植在處理過的SIS材料表面的細胞MTT數(shù)值.

圖2 MTT法測定內皮細胞在SIS上增值情況Fig.2 Proliferation of ECs on SIS by MTT methods

由圖2可以得出細胞增殖情況的趨勢，即隨著時間的延長而按成比例的增加.在第7 d時數(shù)值仍有所增加，說明在第7 d時細胞并未因長滿而出現(xiàn)生長停滯或者凋亡的現(xiàn)象.

圖3為在不同時間，EC與SIS支架材料復合過程中細胞形態(tài)學觀察情況.

由圖3可以看出，血管內皮細胞與SIS基質復合的過程中，大鼠內皮細胞在剛種植時，細胞多呈現(xiàn)出圓形狀；隨著時間的延長，細胞逐漸在材料上延伸生長并增殖，呈現(xiàn)多角形，開始伸出偽足；第1 d時多數(shù)細胞在支架材料上鋪展開，呈現(xiàn)不規(guī)則的形狀；第3 d時細胞已經(jīng)開始增殖；第5 d時內皮細胞大量增殖，內皮細胞在材料上生長良好，材料上有多個細胞密集區(qū)，表現(xiàn)出“鵝卵石”樣排列；第7 d時細胞生長良好，細胞分布比較均勻，鋪滿整個材料表面.

圖4所示為內皮細胞種植支架材料后第5 d時的掃描電鏡照片.

由圖4可以看出，此時，內皮細胞分泌的細胞外基質已經(jīng)粘連在一起，形成一定的網(wǎng)絡結構.由于小腸黏膜下層是天然的生物材料，含有生物信息，能夠提供細胞所需的信號，推測其上所含有的部分生長因子能促進內皮細胞在支架材料上的黏附與增殖.

圖3 EC與SIS材料復合過程中細胞形態(tài)學檢測Fig.3 Cell morphology test of adhesion to ECs on SIS after implanted

圖4 組織工程化血管的掃描電鏡觀察Fig.4 SEM micrographs of tissue engineering blood vessels

3 結論

本實驗采用鹽溶液和胰酶共同處理得到脫細胞小腸黏膜下層，細胞去除完全，纖維保存良好.大鼠內皮細胞在SIS上黏附生長良好，說明SIS具有良好的細胞相容性，能夠促進血管種子細胞在其上的黏附和增殖，可作為組織工程血管的支架材料.

參考文獻：

[1]張 炎，劉太華，姜宗來，等.全生物化組織工程血管構建的初步研究 [J].生物醫(yī)學工程學雜志，2005，22（3）：448-451.

[2]ISENBERG B C，WILLIAMS C，TRANQUILLO R T.Smalldiameter artificial arteries engineered in vitro[J].Circ Res，2006，98（1）：25-35.

[3]CAMPOCCIA D，DOHERTY P，RADICEM，et al.Semisynthetic resorbable materials from hyaluronan ester ification[J]. Biomaterials，1998，19（23）：2101-2127.

[4]郭 勇，張西正，李瑞欣，等.小腸黏膜下層的制備及其在心肌組織工程中的應用[J].解放軍醫(yī)學雜志，2008，33（11）：1304-1306.

[5]潘禮龍，戴 敏，王 偉.大鼠主動脈內皮細胞原代培養(yǎng)的研究[J].中國藥理學通報，2007，23（3）：410-413.

[6]韓本松，范存義，劉生和，等.不同應力環(huán)境對組織工程血管形成的影響 [J].中國修復重建外科雜志，2007，21（3）：302-306.

Primary research on cytocompatibility of endothelial cells and small intestinal submucosa

SUN Qing-lan1，ZHANG Hua1，ZHANG Xi-zheng2，GUO Yong2，LI Rui-xin2，ZHAN Rui3
（1.School of Science，Tianjin Polytechnic University，Tianjin 300160，China；2.Institute of Medical Equipment，Academy of Military Medical Sciences，Tianjin 300161，China；3.Institute of Hygiene and Environmental Medicine，Academy of Military Medical Sciences，Tianjin 300050，China）

As the scaffolds of the vascular tissue engineering，the small intestinal submucosas matrix are obtained by salt solution swelling and enzyme digestion，and vascular endothelial cells are isolated from the rat thoracic aorta and subcultureed and purified.The ECs are seeded on the surface of scaffolds to determine whether the scaffolds had the cytocompatibility.Experimental results show that the seeded endothelial cells proliferate rapidly on the small intestinal submucosa matrix.About 96%of the cells adhere to the surface of the material in the 4 hours after being seeded，and the Ecs grow obviously on scaffolds by the MTT method.The morphological observation of cells shows that cells grow well on the scaffold materials.

small intestinal submucosa；scaffolds；endothelial cells；tissue engineering

book=3,ebook=96

R318.08

A

1671－024X（2010）03－0071－03

2009-09-28 基金項目：國家重點基礎研究發(fā)展計劃（973計劃）（2005CB623904）

孫慶蘭（1985—），女，碩士研究生.

張 華（1961—），女，教授，導師.E-mail：hua1210@126.com