DNA電化學生物傳感器的研究進展

張愛春，周 存，2

（1.天津工業(yè)大學 材料科學與工程學院，天津 300160；2.天津紡織纖維界面處理工程中心，天津 300160）

DNA電化學生物傳感器的研究進展

張愛春1，周 存1，2

（1.天津工業(yè)大學 材料科學與工程學院，天津 300160；2.天津紡織纖維界面處理工程中心，天津 300160）

介紹了DNA電化學生物傳感器的組成及原理，綜述了近年來單鏈DNA的固定以及雜交信號的電化學檢測方面的研究進展，探討了納米材料、納米技術(shù)在DNA電化學生物傳感器的制備及應用中發(fā)揮的作用，并對DNA電化學生物傳感器的發(fā)展方向進行了展望.

DNA電化學生物傳感器；修飾電極；雜交；納米材料

當今，在臨床、法醫(yī)學、藥學領(lǐng)域的應用中實現(xiàn)在低濃度下對特定序列的DNA快速、簡單的檢測是十分重要的[1].基于電化學檢測方法的DNA電化學生物傳感器由于簡單、快速、無毒、成本低、靈敏度高和可用于活體檢測等優(yōu)勢引起了廣泛的關(guān)注[2-3].DNA電化學生物傳感器是從20世紀90年代中期逐漸發(fā)展起來的一種新的傳感器技術(shù)，它的基本結(jié)構(gòu)包括一個能固定DNA探針的電極和一個換能器[4]，通過在電極表面雜交反應選擇性的識別DNA片段.納米材料由于比表面積大、生物活性中心多、表面原子配位不全、吸附能力強且具有無毒副作用、良好的生物相容性、耐腐蝕等優(yōu)異的性能[5-6]，為DNA電化學生物傳感器的研究提供了新的途徑.本文在介紹DNA電化學生物傳感器設(shè)計原理的基礎(chǔ)上闡述了近年來在DNA固定方面以及雜交信號的電化學檢測方面的研究進展，著重分析了納米材料在DNA電化學生物傳感器構(gòu)建中發(fā)揮的獨特作用，并對其發(fā)展方向進行了展望.

1 DNA電化學生物傳感器的設(shè)計

DNA電化學生物傳感器的工作原理[7-8]是將ssDNA作為敏感元件固定在固體電極表面，加入具有電活性的物質(zhì)作為雜交指示劑，通過檢測修飾電極在待測溶液中電化學信號的變化，以確定靶DNA序列；或者將待測基因片段固定在電極表面，然后與溶液中的已標定雜交指示劑的DNA探針進行雜交，來檢測待測基因序列.

具體來說，DNA電化學生物傳感器測定DNA包括4個過程，如圖1所示.①DNA探針的固定，即要將ssDNA固定到電極表面，形成DNA探針修飾電極.②雜交過程，將DNA探針電極放入與之互補的cssDNA被測溶液中，兩者在電極表面雜交形成dsDNA，這一過程必須控制合適的雜交條件，如雜交溫度、DNA固定液pH值、雜交時間等.③雜交的指示，也就是如何將雜交信號轉(zhuǎn)化為可測定的電化學信號.④電化學信號的檢測，一般將電流、電壓或電導作為檢測信號.

圖1 DNA電化學生物傳感器工作原理圖Fig.1 Principle of DNA electrochemical biosensor

1.1 單鏈DNA在電極表面的固定

DNA探針在電極表面的固定是DNA電化學生物傳感器制作中的首要問題[9].要解決這個問題，選擇合適的探針是非常重要的.根據(jù)實踐經(jīng)驗，在選擇DNA探針時應遵循以下4個原則：①探針長度為18～50個堿基，過長會導致雜交時間長、雜交效率低，而過短會缺少雜交的特異性.②G、C堿基的組成比例在40%～60%之間，否則會導致非特異性雜交增加.③在探針分子內(nèi)不能存在互補區(qū)，否則會導致“發(fā)卡”現(xiàn)象，抑制探針雜交.④盡量避免在探針序列中連續(xù)出現(xiàn)一個堿基多次重復（其長度＞4）如GGGGG等.為了把DNA牢固連接在電極表面，往往需要借助以下有效的物理或化學方法：

（1）吸附法.主要是利用DNA片段中帶負電的磷酸骨架與帶正電的固體基質(zhì)表面的靜電相互作用而將DNA固定在支持物上的，可直接[10]或恒電位[11]將ssDNA吸附于基底電極表面.另外，電極表面沉積納米顆粒后可提高DNA的固定量.Zhu等[12]在金電極表面電沉積一層納米二氧化鋯，利用其與磷酸殘基的特異性結(jié)合固定DNA.Zhang等[13]在金電極上自組裝半胱氨酸后固定硅烷基化的納米二氧化硅，然后再將DNA修飾到電極上.

（2）共價鍵合法.通過DNA端部的修飾官能團與電極表面的修飾物形成共價鍵合作用，如酰胺鍵、酯鍵、醚鍵等.由于碳質(zhì)電極表面易于引入各種官能團，所以大多采用碳質(zhì)電極作為基底電極.Li等[3]發(fā)明了一種制備DNA電化學傳感器的新方法，他們將NH2-ssDNA探針共價鍵合到電極表面自組裝了4-ATP單分子層的金電極上，取得了理想效果.張懷等[14]利用單壁碳納米管（SWNTs）上的羧基與DNA末端的氨基形成酰胺共價鍵從而共價修飾SWNTs，制備了新型DNA共價修飾SWNTs電極，并對其性能做了研究.

（3）自組裝法.由于金電極與巰基之間有很強的共價鍵和作用，并能與氨基發(fā)生靜電作用，所以自組裝法一般以金電極為基體電極.基于分子自組裝作用，巰基化合物和氨基化合物可在金電極表面形成高度有序的單分子自組裝膜（SAM）[15-17]，再利用SAM的活性基團固定ssDNA.實際應用中還可以通過在DNA片段的一端修飾巰基或氨基利用自組裝作用將其固定到金電極上[18-19].和裸金電極相比，HS-DNA更容易結(jié)合在金溶膠上，因此金溶膠可以提高電極表面探針DNA的密度，圖2是在金電極表面固定納米金后以自組裝法固定DNA的示意圖.

圖2 金電極上自組裝法固定DNA示意圖Fig.2 Schematic diagram of DNA immobilization on gold electrode by self-assembly mothod

趙紅秋等[20]利用雙硫醇分子作聯(lián)接劑，將金納米粒子固定在金片上，在實驗條件下，經(jīng)過納米金顆粒修飾的金片對HS-DNA探針的吸附量比未經(jīng)修飾的金片可提高3～5倍.Herne等[21]發(fā)現(xiàn)HS-DNA與巰基己酸混合固定可消除金電極表面DNA的非特異型吸附，同時發(fā)現(xiàn)離子強度對HS-DNA在金表面的覆蓋率起決定作用，高離子強度條件下，金電極表面HSDNA覆蓋率高.

（4）生物素-親和素法.生物素與親和素的結(jié)合具有專一、迅速和穩(wěn)定（kD=1015）的特點,用生物素-親和素法固定DNA時，一般是先將親和素通過共價偶聯(lián)或靜電作用連接于電極表面，再利用生物素與親和素之間極強的專一親和作用將生物素修飾的DNA固定在固體支持物上.Ebersole[22]首先把親和素接到石墨電極上，然后再固定被生物素衍生化的DNA探針. Cai等[23]使含有親和素的7-羥基-6-甲氧基香豆素在氧化銦錫電極上電聚合，把親和素包埋在聚合物膜內(nèi)，固定修飾有生物素的ssDNA.

（5）聚合物膜法.可以綜合利用共價鍵合法和吸附法將DNA固定于膜內(nèi)，進而對電極進行修飾.用聚合物膜修飾電極時，可將聚合物溶液在電極表面上滴涂制備，也可由含氧化還原的單體在電極表面上電化學聚合成膜.目前最為常見的是電化學聚合電子導電型聚合物膜.蔡軍等[24]以鉑電極上聚合的2，6-吡啶二甲酸（PDC）膜組裝G5.0樹狀高分子（PAMAM）固定ssDNA探針，并用[Fe（CN）6]3-/4-作氧化還原指示劑，以電化學交流阻抗和循環(huán)伏安技術(shù)對探針ssDNA的固定和雜交進行了表征，實驗結(jié)果表明，當ssDNA在復合膜上固定及與其互補序列雜交后，電極表面的傳遞電阻（Ret）依次增大.

1.2 DNA雜交的電化學轉(zhuǎn)換

DNA電化學生物傳感器通過檢測電化學信號指示雜交情況從而實現(xiàn)對特定序列DNA的檢測，根據(jù)是否需要電化學指示劑可將檢測方法分為直接檢測和間接檢測兩大類.

1.2.1 電化學信號的直接檢測

直接檢測法是指直接檢測由雜交行為引起的自身電信號的改變.最常用的是DNA堿基中的鳥嘌呤（G）[25]，它具有電化學活性，很容易發(fā)生氧化反應，雜交后由于dsDNA雙螺旋外側(cè)的脫氧核糖阻礙內(nèi)側(cè)堿基的電化學反應，導致G的電化學氧化信號下降，因此，可以用G的電信號的變化直接檢測DNA雜交.Wang等[26]用固定dsDNA的微型電化學傳感器，基于DNA中鳥嘌呤的氧化信號變化探討了紫外光輻射引起的DNA損傷，包括DNA的構(gòu)象變化及其鳥嘌呤的光致化學反應.張錢麗等[27]以活化微碳圓盤電極為工作電極，鉑電極為對電極，Ag/AgCl電極為參比電極，研究了鳥嘌呤的電化學行為，實驗結(jié)果表明：在pH=8.20的Britton-Robinson（BR）緩沖溶液中，鳥嘌呤在0.780 V有一氧化峰，工作電極在1.0 mol/L的NaOH溶液中活化5 min后，鳥嘌呤的氧化電流響應明顯提高，氧化峰電流和鳥嘌呤濃度在1.0×10-6～1.0×10-4mol/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢測限為6.0×10-8mol/L.

1.2.2 基于指示劑的間接檢測

（1）非標記型雜交指示劑作為識別物.雜交指示劑是指能與ssDNA和dsDNA以不同非共價方式相互作用的電化學活性化合物，基于其與ssDNA和dsDNA選擇性結(jié)合能力的差異達到指示DNA的雜交是否發(fā)生和發(fā)生程度的目的.一般來說，雙鏈DNA與指示劑的相互作用為靜電作用和內(nèi)部疏水作用,而單鏈DNA主要是靜電作用.常用的雜交指示劑有亞甲基藍[28]、Co（phen）32+[29]、[Fe（CN）6]3-/4-[18]等.

（2）標記型雜交指示劑作為識別物.標記了電活性雜交指示劑的核苷酸與電極表面的靶基因選擇性地進行雜交反應，在電極表面形成帶有電活性官能團的雜交分子，通過測定其電信號可以識別和檢測DNA分子.徐春等[30]以EDC為偶聯(lián)活化劑，利用縮合反應，分別將電化學活性物質(zhì)氨基二茂鐵（AFC）和醛基二茂鐵（FCA）成功的標記在變性小牛胸腺DNA片段上，制備成了二茂鐵標記DNA探針.Zhu[31]合成了一種表面有自由羧基的硫化鉛的納米粒子，然后將它作為標記物接到一段已知序列的寡核苷酸上，將這個合成物充當探針與固定在聚吡咯膜中的靶基因進行雜交，采用陽極溶出伏安法檢測由于雜交而使硫化鉛氧化溶解出的鉛離子，從而判定雜交是否成功，檢測限達到0.3 mol/L.

2 納米材料在DNA電化學生物傳感器制備中的應用

納米材料所具有的表面效應、小尺寸效應、量子尺寸效應和宏觀量子隧道效應使其在力學、電學、磁學、熱學、光學以及化學活性等方面都表現(xiàn)出特殊的性質(zhì).在DNA電化學生物傳感器領(lǐng)域引入納米材料主要起到以下幾種作用：

（1）加速電子傳遞.許多納米材料如碳納米管[32]和金屬納米粒子[33]等都具有良好的導電性能，將其作為導線連在生物分子與電極之間，既能起到加快異相界面電子傳遞速率的作用（宏觀量子隧道效應），又能增加氧化還原物質(zhì)在電極表面反應的可逆性，是優(yōu)良的電極修飾材料.納米復合顆粒比單一納米顆粒更易于形成連續(xù)勢場，提高電子遷移速率，所以復合納米顆粒在增強傳感器的電流響應、提高靈敏度方面性能更優(yōu)異.Cai等[34]合成了一種新的Cu@Au核殼型納米粒子，并將其通過5′-烷基硫醇標記到核苷酸上制備成納米標記的寡聚核苷酸探針，然后與通過靜電吸附作用吸附在聚吡咯修飾的玻碳電極表面的目標基因片段雜交，將標記物中的納米粒子溶解后用高靈敏的陽極溶出伏安法測定，檢測大腸桿菌毒素目標基因的下限為5.0 pmol/L.

（2）作為固定載體增加ssDNA在電極表面的吸附量.納米材料因具有比表面積大、表面自由能高、生物相容性好等特性，使DNA探針在其表面的吸附量得到很大程度提高，并較好的保持其生物構(gòu)型及活性.楊婕[35]在玻碳電極（GCE）上電聚合2，6-吡啶二甲酸（PDC），采用電沉積和浸泡結(jié)合法將納米金（NG）修飾在PDC/GCE膜上制備NG/PDC/GCE電極，并將DNA探針固定在NG/PDC/GCE電極上，分別以亞甲基藍為指示劑的循環(huán)伏安法和在[Fe（CN）6]3-/4中的交流阻抗譜技術(shù)對DNA的固定和雜交進行了表征，結(jié)果表明納米金修飾于聚2，6-吡啶二甲酸膜上可大大提高DNA探針的固定量.Liu等[36]直接在金電極上于-200 mV單電位模式下電沉積含0.1 mol/L KNO3的HAuCl4溶液，制備成納米金粒子金電極，以亞甲基藍為電化學指示劑采用循環(huán)伏安法表征了DNA的固定與雜交，發(fā)現(xiàn)DNA的固定與雜交量大大提高，靈敏度顯著提高.

（3）作為電化學標記物增強和放大電信號.通常用于DNA電化學分析的納米標記粒子主要有金屬納米粒子和半導體納米粒子.許多文獻報道了膠體金在DNA電化學生物傳感器中的信號放大作用，并在此基礎(chǔ)上發(fā)展了金標銀染法.蔡宏[37]將納米金膠標記于人工合成的5′-端疏基修飾的寡聚核苷酸片段上，制備成具有電化學活性的金膠標記DNA電化學探針，然后利用殼聚糖和寡聚核苷酸之間的靜電作用將要檢測的寡聚核苷酸固定于殼聚糖修飾的玻碳電極上，用差分脈沖伏安法對雜交效果進行了檢測，結(jié)果表明：基于納米金標記的DNA探針電化學傳感器有較強的序列選擇性.他進而用金標銀染技術(shù)對大腸桿菌腸毒素基因片段進行了檢測，由于銀顆粒的氧化還原電信號較強，銀染后，雜交信號被放大了近2個數(shù)量級.另外，值得一提的是磁性納米粒子[38]由于其優(yōu)異的磁性能也被用于標記識別因子，這給醫(yī)學的發(fā)展提供了空間，比如在腫瘤檢測中，將納米磁性顆粒與腫瘤表面的靶標識別器結(jié)合后，可在體外測定磁性顆粒在體內(nèi)的分布和位置，從而給腫瘤定位.

3 結(jié)束語

DNA電化學生物傳感器的研究工作開辟了電化學與分子生物學的新領(lǐng)域，為生命科學的研究提供了一種全新的方法.目前，國內(nèi)的研究還處于起步階段.近年來，納米顆粒應用于DNA電化學生物傳感器已經(jīng)取得了很大進步，但目前所使用的納米顆粒的種類很有限，針對納米生物材料的生物功能化的研究尚不深入.為進一步提高DNA電化學生物傳感器的靈敏度和響應電流，在納米材料制備方法的改性、各種形式的有機或無機納米材料的應用以及基底電極的開發(fā)及修飾等方面仍有較大的發(fā)展空間.在DNA片段的修飾方面，研究工作也主要集中在寡聚核苷酸的5′-端進行巰基修飾形成巰基化寡聚核苷酸探針，然后再與納米金結(jié)合，這也有待科學工作者進行更深入的研究，探索新的探針修飾手段.在電信號的檢測方面，也需要不斷開發(fā)新的雜交指示劑，實現(xiàn)對特定DNA序列的檢測.

[1]LI Feng，CHEN Wei，ZHANG Shusheng.Development of DNA electrochemical biosensor based on covalent immobilization of probe DNA by direct coupling of sol-gel and self-assembly technologies[J].Biosensors and Bioelectronics，2008，24（4）：781-786.

[2]黃 強，劉紅英，方 賓.電化學DNA生物傳感器研究的應用前景[J].化學進展，2009，21（5）：1052-1058.

[3]LI Feng，CHEN Wei，ZHANG Shusheng.A simple strategy of probe DNA immobilization by diazotization-coupling on selfassembled 4-aminothiophenol for DNA electrochemical biosensor[J].Biosensiors and Bioelectronics，2009，24（7）：2160-2164.

[4] 趙元弟，龐代文，王宗禮，等.電化學脫氧核糖核酸傳感器[J].分析化學，1996，24（3）：364-368.

[5]楊海朋，陳仕國，李春輝，等.納米電化學生物傳感器[J].化學進展，2009，21（1）：210-216.

[6]項 純.談納米材料修飾電極在生物電化學中的應用[J].中國新技術(shù)新產(chǎn)品，2009（9）：17.

[7]PIVIDORI M I，MERKOCI A，ALEGRET S.Electrochemical genosensor design：immobilisation of oligonucleotides onto transducer surfaces and detection methods[J].Biosens Bioelecton，2000，15（516）：291-293.

[8]任 勇.DNA探針在固體電極上的固定以及對轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品的檢測[D].青島：青島科技大學，2006.

[9]LUCARELLI F，MARRAZZA G，TURNER A P F，et al.Carbon and gold electrodes as electrochemical transducers for DNA hybridisation sensors[J].Biosens Bioelectron，2004，19（6）：515-530.

[10] XUC，CAIH，HEP，et al.Characterization of single-stranded DNA on chitosan-modified electrode and its application to the sepuence-specific DNA detection[J].Fresenius J Anal Chem，2001，369（5）：428-432.

[11] DELL A D，Tombelli S，Minunni M，et al.Detection of clinically relevant point mutations by a novel piezoelectric biosensor[J].Biosens Bioelectron，2006，21（10）：1876-1879.

[12]ZHU N N，ZHANG A P，WANG Q J，et al.Electrochemical detection of DNA hybridization using methylene blue and electro-deposited zirconia thin films on gold electrodes[J]. Anal Chim Acta，2004，510（2）：163-168.

[13] ZHANG D，CHEN Y，CHEN H Y，et al.Silica-nanoparticle-based interface for the enhanced immobilization and sequence-specific detection of DNA[J].AnalBioanal Chem，2004，379（7/8）：1 025-1 030.

[14]張 懷，張云懷，李 靜，等.DNA共價修飾單壁碳納米管電極的制備及與VB6相互作用的研究[J].分析測試學報，2008，27（8）：830-834.

[15]WROBLE N，DEININGER W，HEGEMANN P，et al.Covalent immobilization of oligonucleotides on electrodes[J].Colloids and surfaces B，2003，32（2）：157-162.

[16] KERMAN K，DILSAT O，PINAR K，et al.Voltammetric detection of DNA hybridization using methylene blue and selfassembled alkanethiol monolayer on gold eletrodes[J].Anal Chim Acta，2002，462（1）：39-47.

[17]周家宏，楊 輝，邢 巍，等.一個制備脫氧核苷酸修飾電極的簡便方法[J].應用化學，2001，18（7）：575-578.

[18]郝青麗，王安子，程榮恩，等.金電極上巰基修飾單鏈DNA對[Fe（CN）6]3-/4-的電催化作用[J].南京理工大學學報：自然科學版，2009，33（6）：388-392.

[19]DU Ping，LI Hong Xia，MEI Zhenhua，et al.Electrochemical DNA biosensor for the detection of DNA hybridization with the amplification of Au nanojarticles and cds nanoparticles[J]. Bioelectrochemistry，2009，75（1）：37-43.

[20]趙紅秋，林 琳，唐季安.利用納米金顆粒增強DNA探針在傳感器上的固定程度和識別能力 [J].科學通報，2001，46（4）：292-296.

[21]HERNE T M，TARLOV M J.Characterisation of DNA probes immobilized on gold surfaces[J].Am Chem Soc，1997，119（38）：8916-8920.

[22]EBERSOLE R，MILLER J，MORAN J，et al.Spantaneously formed functionally active avidin monolayers on metal surfaces：a strategy for immobilizing biological reagents and design of piezoelectric biosensors[J].Am Chem Soc，1990，112（8）：3239-3241.

[23]CAI H，SHANG C，HSING I M.Sequence-specific eletrochemical recognition of multiple species using nanopareicle labels[J].Anal Chim Acta，2004，523（1）：61-68.

[24]蔡 軍，艾仕云，殷煥順，等.基于PAMAM/聚2，6-吡啶二甲酸膜DNA電化學生物傳感器的制備及對禽病毒檢測的研究[J].化學學報，2009，67（19）：2227-2232.

[25]KERMAN K，KOBAYASHI M，TAMIYAL E.Recent trends in electrochemical DNA biosensor technology[J].Meas Sci Technol，2004，15（2）：R1-R11.

[26]WANG J，RIVAS G，OZSOZ M，et al.Microfabricated electrochemical sensor for the detection of radiation-induced DNA damage[J].Anal Chem，1997，69（7）：1457-1460.

[27] 張錢麗，黃明國，屠一鋒.活化微碳圓盤電極用于鳥嘌呤測定的研究[J].蘇州科技學院學報：自然科學版，2009，26（2）：64-66.

[28]許世超，張紀梅，姚翠翠，等.以亞甲基藍為雜交指示劑的DNA電化學傳感器[J].精細化工，2008，25（12）：1183-1186.

[29]逄介淳，張紀梅，代 昭.以配合物為指示劑的新型DNA電化學傳感器的研究[J].遼寧化工，2009，38（1）：1-5.

[30]徐 春，蔡 宏，何品剛，等.二茂鐵標記DNA電化學探針的研制及性質(zhì)研究[J].高等學校化學學報，2001，22（9）：1492-1495.

[31]ZHU N N，ZHANG A P，WANG Q J.Lead sulfide nanoparticle as oligonucleotides labels for electrochemical stripping detection of DNA hybridization[J].Electroanalysis，2004，16（7）：577-579.

[32]鄭燕瓊，楊昌柱，張敬東，等.多壁碳納米管修飾玻碳電極選擇性測定色氨酸[J].華中科技大學學報：自然科學版，2008，36（5）：125-128.

[33] LIU Cheng hui，LI Zheng ping，DU Bao an，et al.Silver nanoparticle-based ultrasensitive Chem iluminescent detection of DNA hybridization and single-ucleotide polymorphisms[J].Anal Chem，2006，78（11）：3738-3744.

[34] CAI H，ZHU N N，JIANG Y，et al.Cu@Ag alloy nanoparticle as olignucleotides labels for electrochemical stripping detection of DNA hybridization[J].Biosensors and Bioelectronics，2003，18（11）：1311-1319.

[35]楊 婕.聚合物膜制備DNA電化學傳感器及納米材料在其中的應用[D].青島：青島科技大學，2007.

[36] LIU S F，LI Y F，LI J R.Enhancement of DNA immobilization and hybridization on gold electrode modified by nanogold aggregates[J].Biosensors and Bioelectronics，2005，21（5）：789-795.

[37]蔡 宏.新型DNA電化學生物傳感器的研制及納米材料在其中的應用[D].上海：華東師范大學，2003.

[38]程圭芳，黃翠華，趙 潔，等.新型磁性納米電化學DNA生物傳感器的研究 [J].分析化學，2009，37（2）：169-173.

Progresses of DNA electrochemical biosensor

ZHANG Ai-chun1，ZHOU Cun1，2
（1.School of Material Science and Processing Engineering，Tianjin Polytechnic University，Tianjin 300160，China；2. Tianjin Textile Fiber Interfacial Processing Engineering Center，Tianjin 300160，China）

The constitution and principle of DNA electrochemical biosensor are introduced，and the research progress in recent years about the immobilization of single strand DNA and the electrochemical detection of hybridization signal is reviewed，the specific effect of nano materials and nano technology in DNA electrochemical biosensor is also expounded.A prospect for the future development in this field is given briefly.

DNA eletrochemical biosensor；modified electrode；hybridization；nano materials

book=3,ebook=87

TP212.3

A

1671－024X（2010）03－0066－05

2010-01-06

張愛春（1986—），女，碩士研究生.

周 存（1972—），男，副研究員，碩士生導師.E-mail:zhoucun@tjpu.edu.cn