鵝不食草總有機(jī)酸的提取與分析

陳琦 王尚

鵝不食草(Centipeda minima(L.)A.Br.et Aschers.)為菊科植物鵝不食草的干燥全草。據(jù)《本草綱目》記載有通竅，止咳之功。主治風(fēng)寒感冒，咳嗽痰多，鼻塞不通，鼻淵流涕等。

主要含有甾醇類、黃酮類、三萜皂苷、揮發(fā)油、胺類，有機(jī)酸等成分。近年來，針對(duì)其所含甾醇類、皂苷類、黃酮類等成分［1］研究較多，但有機(jī)酸類成分作為其重要組成部分還未見

1 儀器與試藥

UV-1700型紫外可見分光光度計(jì)(日本島津);BP211D電子天平(德國賽多利司);超聲波清洗器;烘箱;水浴鍋;真空泵;加熱套;pH試紙;沒食子酸對(duì)照品(含量測定用，中國藥品生物制品鑒定所);鵝不食草(采于吉林長白縣);其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 鵝不食草總有機(jī)酸的提?。?，3］

2.1.1 超聲提取法 取鵝不食草粉末50 g加蒸餾水1000 ml浸泡1 h，超聲提取1 h，過濾，殘?jiān)诱麴s水1000 ml，再次超聲提取1 h，過濾，合并2次濾液，水浴鍋(60℃)上濃縮得浸膏，浸膏減壓真空干燥(60℃)，干品即為鵝不食草總有機(jī)酸提取物。

2.1.2 堿提酸沉法 取鵝不食草粉末50 g加入蒸餾水1000 ml浸泡1 h，超聲提取1 h，過濾，殘?jiān)诱麴s水1000 ml，再次超聲提取1 h，過濾，合并兩次濾液，加入飽和鹽酸乙醚萃取，乙醚層再用2%碳酸氫鈉溶液萃取，碳酸氫鈉水溶液用濃鹽酸調(diào)制，pH值到2，再用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯后于水浴鍋(60℃)上濃縮干燥，干品即為鵝不食草總有機(jī)酸提取物。

2.1.3 酸沉后有機(jī)溶劑萃取法 精密稱取鵝不食草粉末200 g于5000 ml圓底燒瓶中，加蒸餾水3000 ml回流提取。提取三次，每次1.5 h，合并三次提取液，水浴鍋(60℃)上濃縮(相對(duì)密度1.05)，濃鹽酸調(diào)制濃縮液，pH值到2，用乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯溶液，回收乙酸乙酯，并于水浴鍋(60℃)上濃縮干燥，干品即為鵝不食草總有機(jī)酸提取物。

2.1.4 有機(jī)溶劑加酸水直接提取法 精密稱取鵝不食草粉末200 g于5000 ml圓底燒瓶中，在70%乙醇溶液中加入濃鹽酸，pH值到2，在圓底燒瓶中加入70%乙醇酸水溶液3000 ml，回流提取三次，每次1.5 h，合并三次提取液，水浴鍋(60℃)上濃縮(相對(duì)密度1.05)，用適量乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯，并于水浴鍋(60℃)上濃縮干燥，干品即為鵝不食草總有機(jī)酸提取物。

2.2 鵝不食草總有機(jī)酸的含量測定［4，5］

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取一定量沒食子酸的對(duì)照品，用無水乙醇將其溶解，定容配成沒食子酸(20.5μg/ml)儲(chǔ)備液。

2.2.2 試品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取以上四種方法所得鵝不食草總有機(jī)酸提取物各0.02 g，置25 ml容量瓶中，無水乙醇定容至刻度，在精確量取1 ml樣品溶液置10 ml容量瓶中，無水乙醇定容至刻度，即得樣品溶液。

2.2.3 最大波長的選擇 取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液及堿提酸沉法樣品溶液各1 ml，置10 ml容量瓶中，加無水乙醇5 ml，0.3%十二烷基硫酸鈉2 ml，1%鐵氰化鉀-1%三氯化鐵(1:1)混合液1 ml，搖勻，暗處放置5 min，加0.1 mol/LHCl至刻度，搖勻，暗處放置20 min，平行空白，在500～900 nm波長范圍內(nèi)掃描。結(jié)果表明，對(duì)照品和供試品最大吸收波長在730 nm波長處，故選擇測定波長為730 nm。吸收光譜圖如下。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品與樣品吸收光譜圖

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別取對(duì)照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0 ml，置10 ml容量瓶中，加無水乙醇至6 ml，按2.2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行測定，自“0.3%十二烷基硫酸鈉2 ml”起，依法測定其吸收度。以含量(C)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析，得出回歸方程為:A=529.19C+0.0463，R=0.991。結(jié)果表明溶液濃度在 0.416μg/ml～2.08μg/ml范圍內(nèi)，吸光度與濃度呈良好線性關(guān)系。

2.2.5 樣品含量測定 分別量取上述四種方法樣品溶液各1 ml，按2.2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行含量測定，自“0.3%十二烷基硫酸鈉2 ml”起，依法測定其吸收度，用直線回歸法計(jì)算總有機(jī)酸含量。測定結(jié)果見下表。

表1 不同提取方法鵝不食草有機(jī)酸含量

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度實(shí)驗(yàn) 精密稱取鵝不食草粉末50 g，按2.1.2項(xiàng)下提取方法進(jìn)行提取，同時(shí)按2.2.5項(xiàng)下的方法進(jìn)行含量測定，平行測定6次，記錄每次含量測定結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果RSD為0.35%(n=6)，顯示精密度良好。

2.3.2 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 按2.1.2項(xiàng)下提取方法提取鵝不食草總有機(jī)酸，平行制備6份，同時(shí)按2.2.5項(xiàng)下的方法進(jìn)行含量測定。含量測定結(jié)果RSD為0.73%(n=6)，實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性好。

2.3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密稱取鵝不食草粉末50 g，按2.1.2項(xiàng)下提取方法進(jìn)行提取，分別于 0、2、4、6、8、12、24 h 時(shí)，按2.2.5項(xiàng)下的方法進(jìn)行含量測定，結(jié)果24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性較好，RSD為0.612%。

2.3.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取鵝不食草粉末50 g，精密加入沒食子酸對(duì)照品4 mg，平行6次，按2.1.2項(xiàng)下提取方法進(jìn)行提取，同時(shí)按2.2.5項(xiàng)下的方法進(jìn)行含量測定，記錄每次含量測定結(jié)果。平均回收率97.5%，RSD=1.91%。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)鵝不食草總有機(jī)酸成分提取實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)，最終確定堿提酸沉法為其最佳提取方法，總有機(jī)酸含量達(dá)到67%以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他三種提取方法。但采用碳酸氫鈉提取有機(jī)酸時(shí)未考慮酚性物質(zhì)的溶解和酯類物質(zhì)的水解，被溶解或水解掉的部分是否為有效成分，其水解后會(huì)不會(huì)影響藥物的療效等問題尚需進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)以鐵氰化鉀-三氯化鐵為顯色劑，采用分光光度法測定鵝不食草有機(jī)酸含量，方法學(xué)考察結(jié)果表明，分光光度法法測定鵝不食草藥材中的總有機(jī)酸的方法簡便、快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，實(shí)用性強(qiáng)。

鵝不食草是我國東北地區(qū)常用中藥，有機(jī)酸類成分是其有效成分之一，但尚無對(duì)其含量測定的報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)對(duì)其所含有機(jī)酸定量的研究，可為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供方法學(xué)的參考，以控制藥材質(zhì)量，保證臨床療效，為進(jìn)一步開發(fā)鵝不食草資源奠定基礎(chǔ)。

［1］劉宇.鵝不食草的化學(xué)成分及生物活性研究進(jìn)展.湖北中醫(yī)雜志，2005，27(5):52-53.

［2］王媚，吳皓，等.中藥有機(jī)酸類成分的提取分離及測定方法研究進(jìn)展.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，20(3):190-192.

［3］陳玉昆.中藥提取生產(chǎn)工藝學(xué)(下).沈陽出版社，1992:109.

［4］付煜榮，張萬明，陳桂敏，等.景天三七中沒食子酸和總酚酸含量測定.中成藥，2006，28(7):1016-1018.

［5］張穎，甄攀，馬媛媛，劉淑芬，等.吳茱萸中總皂苷、總黃酮和總酚酸的含量測定.河北北方學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，24(3):27-33.