3-硝基丙酸預處理對大鼠腦組織缺血-再灌注損傷的保護作用與神經(jīng)細胞骨架蛋白的相關性研究

周春奎, 胡雪峰, 趙 騰, 常 明, 張海寧

有報道稱[1],對大鼠進行小劑量 3-硝基丙酸(3-nitropropionic acid,3-NPA)預處理不但不會產(chǎn)生神經(jīng)組織學損傷,反而對再次發(fā)生的局灶性腦缺血產(chǎn)生耐受性,此現(xiàn)象的機制已成為研究熱點。目前,在蛋白質(zhì)組學水平研究 3-NPA對腦缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI)的保護機制尚未見報道。本實驗采用 Zea Longa的大腦中動脈線栓法并加以改進,建立局灶性腦缺血-再灌注模型,以小劑量 3-NPA對預處理組大鼠進行干預,應用差異蛋白質(zhì)組學結合質(zhì)譜鑒定找出預處理組與對照組差異表達的神經(jīng)細胞骨架相關蛋白,通過對存在差異的神經(jīng)細胞骨架蛋白進行功能分析,為進一步探討 3-NPA預處理在 IRI后產(chǎn)生的腦保護作用提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料 CyDye花青素熒光染料(Cy2,Cy3,Cy5)、24cm固相 pH梯度干膠條(Immobilized pH gradient,IPG,pH 4～ 7)、CHAPS、兩性電解質(zhì) (pharmalyte,p H 3～10)、二硫蘇糖醇 (DTT)、碘乙酰胺(IAA)、尿素、丙烯酰胺、甘氨酸、Tris、SDS、Clean-up試劑盒購自 GE Healthcare-Amersham Biosciences(Uppsala,Sweden);L-谷氨酰胺和 3-NPA購自 Sigma Aldrich(Saint Louis,USA)。

1.2 儀器 IPGphor II等電聚焦儀、DALTSix電泳系統(tǒng)、Typhoo9400系列多功能激光掃描成像系統(tǒng)、DeCyder差異分析軟件和 MALDI-TOF質(zhì)譜均為GE Healthcare-Amersham Biosciences公司產(chǎn)品。

1.3 動物及分組 雄性 Wistar大鼠 20只,體重 250～300g,由吉林大學基礎醫(yī)學院實驗動物中心提供及飼養(yǎng)。隨機分組:(1)生理鹽水 +缺血再灌注組(對照組);(2)3-NPA預處理 +缺血再灌注組(預處理組)。3-NPA濃度為 4mg/ml,實驗前用雙蒸水新鮮配制,用 NaOH調(diào)節(jié) pH至 7.4。預處理組大鼠腹腔注射 3-NPA(20mg/kg),對照組腹腔注射等體積生理鹽水,于 72h后分別制作腦缺血-再灌注模型。

1.4 大腦中動脈缺血-再灌注模型制備 采用Zea Longa的大腦中動脈線栓法(MCAO)并加以改進,建立局灶性腦缺血-再灌注模型,大鼠術后 2h完全清醒、神經(jīng)功能障礙評分達 3分、且再灌注 72h后未死亡的動物納入實驗。

1.5 蛋白質(zhì)樣品的制備 大鼠術后分別于72h腹腔內(nèi)注射 10%水合氯醛麻醉,快速斷頭處死,冰上剝離左側大腦,用預冷超純水沖洗腦組織中殘留血液,取梗死病灶側大腦皮層約 100mg(濕重),放入研缽內(nèi),加入提取裂解液 500μl,同時加入 1%核酸酶和 1%蛋白酶抑制劑,混勻,冰浴研磨勻漿,研磨時避免產(chǎn)生氣泡。室溫變性作用 60min,然后15℃,25000r/min離心 30min,收集上清液。蛋白樣品參照 2D Clean-up試劑盒說明書去除雜質(zhì)。用Bradford法測定蛋白質(zhì)樣品濃度。

1.6 CyDye熒光染料標記蛋白質(zhì)樣品 將各樣品 pH值調(diào)至 8.5,每份樣本 50μg避光條件下加入 1μl(400pmol/L)的 CyDye(Cy3、Cy5、Cy2)熒光工作液,其中 Cy2標記 20個樣本各 25μg組成的混合物作為內(nèi)標,具體標記情況如表1所示。參照 Skynner法避光冰浴 30min后,加入 1μl 10mmol/L賴氨酸終止反應。

表1 DIGE膠內(nèi)樣品分組及組成

1.7 熒光差異雙向凝膠(DIGE)電泳制備 分別混合標記后的 3塊膠樣品及內(nèi)標,用重泡漲液(7mmol/L尿素,2mmol/L硫脲,4%CHAPS,1%IPG buffer,40mmol/LDTT,痕量溴酚藍)定容至 450μl。在 20℃,用 IPGphorⅡ等電聚集儀,將 24cm IPG膠條水化重泡漲 6h,按表2所示參數(shù)進行等電聚集電泳。等電聚焦(參數(shù)見表2)后,將膠條分別放置在含 2%DTT和 4%IAA的平衡液中各振蕩平衡 15min,再移至 12.5%的 SDS-PAGE膠(24cm×20cm×1.0mm)上端,酸性端旁置蛋白分子量標志,20℃在 DALTSix電泳儀中 40mA恒電流電泳,直至溴酚藍到達膠的底端。用 Typhoon 9400成像系統(tǒng)掃描雙向電泳凝膠,各熒光染料的激發(fā)光和發(fā)射光波分別為:Cy2,480nm和 530nm;Cy3,540nm和 590nm;Cy5,620nm和 680nm。掃描后的圖像文件用 DeCyder5.0版本軟件分析,應用 BVA模式進行膠與膠之間匹配,不同組間選擇 Student檢驗和單因素方差分析(One-Way ANOVA)。挑選出兩組間具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)的顯著增加或者顯著減少的感興趣差異蛋白點。

表2 等電聚焦電泳參數(shù)

1.8 質(zhì)譜分析及蛋白質(zhì)鑒定 取對照組及預處理組蛋白樣品各 800μg,按常規(guī)方法進行制備膠雙向電泳后,經(jīng)考馬斯亮藍染色,用 Ettan Spot Picker(Amersham Biosciences)機器人挖取與感興趣差異蛋白相匹配的蛋白點。參照 Wilm方法,對所挖取的蛋白點用 50%乙腈沖洗,胰蛋白酶消化,以 Ettan Spotter(Amersham Biosciences)在靶條上進行樣品點樣后,應用基質(zhì)輔助激光解析/電離-飛行時間(MALDI-TOF)質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)肽質(zhì)量指紋譜,并將結果輸入 NCBI和 Swiss-Prot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行檢索。

2 結 果

2.1 DIGE比較各組大鼠腦組織蛋白質(zhì)差異分析 經(jīng) DeCyder-DIAV5.0軟件分析 Cy2、Cy3、Cy5染色的內(nèi)標和對照組及預處理組的 3塊膠,結果可見兩組間膠上的蛋白點分布模式基本一致,每塊膠上平均含有 2668個蛋白點,其中可匹配的蛋白點 2080個。應用 DeCyder-BVA軟件分析蛋白質(zhì)表達量差異,發(fā)現(xiàn) 72h預處理組與對照組相比有 52個蛋白點表達量顯著改變(見圖1)。

2.2 差異蛋白質(zhì)點的質(zhì)譜鑒定和數(shù)據(jù)庫檢索通過質(zhì)譜分析及數(shù)據(jù)庫檢索鑒定出3-NPA預處理組與對照組之間存在明顯差異的蛋白質(zhì)有 15種,其中神經(jīng)細胞骨架相關蛋白 7種,具體如下:ERM家族蛋白(ezrin蛋白、radixin蛋白和 moesin蛋白)、神經(jīng)細絲蛋白輕鏈多肽(neurofilament light polypeptide,NF-L)、神經(jīng)細絲蛋白中鏈多肽(neurofilament medium polypeptide,NF-M)、二氫嘧啶酶相關蛋白 2(dihydropyrimidinase-related protein 2,DRP-2)、巢蛋白(nestin),以上 7種蛋白預處理組較對照組表達均顯著增高(見表3)。

表3 神經(jīng)細胞骨架相關蛋白鑒定結果

圖1 制備膠圖像顯示差異表達的蛋白,綠圈內(nèi)為 3-NPA預處理組與 IRI組的差異表達點

3 討 論

缺血-再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI)是指各種原因造成局部組織器官缺血,使組織細胞發(fā)生缺血性損傷,當在一定條件下恢復血液再灌注后,組織細胞的代謝功能障礙及結構破壞未減輕反而進一步加重。IRI往往引起較缺血本身更為嚴重的損害,導致各種神經(jīng)功能缺損的癥狀,其機制較多,目前公認的有氧自由基、鈣超載、炎癥反應等[2]。細胞骨架蛋白主要功能是維持真核細胞的空間結構,包括微管、微絲或肌動蛋白絲以及中間絲 3種類型。越來越多的事實證明,對細胞骨架的保護在腦損傷恢復中具有重要的意義。細胞骨架的研究將成為缺氧缺血性腦損傷研究的熱點。

預適應(preconditioning)是指一次或多次短暫、非致命性刺激后,機體、組織或細胞能對其后一段時間內(nèi)嚴重、甚至致命性損傷產(chǎn)生一定程度耐受的現(xiàn)象,其機制包括低氧誘導因子生成、基因表達的上調(diào)等[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn),一些藥物或化學預處理可以誘導腦組織產(chǎn)生保護作用,稱為藥理性預適應。3-NPA是琥珀酸脫氫酶抑制劑,其進入機體后與琥珀酸脫氫酶共價結合,抑制線粒體電子傳遞和氧化磷酸化過程,阻斷呼吸鏈,引起組織缺氧。Wiegand等[1]報道,小劑量 3-NPA(20mg/kg)預處理不足以產(chǎn)生神經(jīng)組織學損傷,反而對再次發(fā)生的嚴重局灶性腦缺血缺氧產(chǎn)生耐受性。3-NPA預處理具有時間依賴性,預處理后 3～24h即產(chǎn)生效應,持續(xù) 1～4d,以預處理后 3d效應最佳。Riepe等[4]發(fā)現(xiàn)在大鼠腹腔注射 3-NPA 20mg/kg預處理后 1d,腦海馬切片耐受缺血能力明顯提高,神經(jīng)元密度增加約 50%。此外有研究將體外培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元用 3-NPA預處理,發(fā)現(xiàn)預處理后數(shù)小時至 2d這些神經(jīng)元抗缺氧能力明顯增強。目前認為,3-NPA預處理后可以激活機體自身內(nèi)源性保護機制,提高神經(jīng)元對缺血缺氧的耐受性,提高腦組織的抗損傷能力。本實驗應用差異蛋白質(zhì)組學技術,鑒定了 3-NPA預處理組大鼠與IRI組大鼠之間存在差異的蛋白質(zhì) 15種,其中神經(jīng)細胞骨架相關蛋白 7種。

3.1 REM蛋白家族 ERM蛋白家族(ezrin/radixin/moesin)是連接皮層細胞骨架與質(zhì)膜上整合膜蛋白的橋梁分子,其通過介導細胞質(zhì)膜與肌動蛋白等細胞骨架的連接,在細胞的生長、運動、遷移、有絲分裂以及信號轉導等方面發(fā)揮重要作用[5]。在神經(jīng)系統(tǒng)中,ERMs蛋白主要表達于新皮層的中間帶,這個區(qū)域密集了遷移的神經(jīng)元和生長的軸突。在皮層形成過程中,ERMs是主要的細胞骨架連接器,在神經(jīng)元遷移和軸突延伸過程中發(fā)揮重要的功能[6]。有實驗表明,在培養(yǎng)的原代神經(jīng)元細胞中抑制 ERMs的表達,可抑制生長錐和神經(jīng)元軸突的形成[7]。由此可知 ERMs在維持神經(jīng)細胞結構及促進軸突生長方面具有重要的生物學作用。

3.2 神經(jīng)細絲蛋白輕鏈多肽(NF-L)及中鏈多肽(NF-M) 神經(jīng)細絲蛋白(neurofilament protein,NFP)是神經(jīng)細胞特異蛋白,屬于中間絲。NFP廣泛的分布在神經(jīng)細胞的細胞質(zhì)、神經(jīng)突起內(nèi)。脊椎動物的 NFP是由分子量 70kD(L)、145kD(M)、200kD(H)三種不同的蛋白亞基組成的,神經(jīng)細絲蛋白輕鏈多肽(neurofilament light polypeptide,NF-L)亞基出現(xiàn)最早并構成 NF的核心,神經(jīng)細絲蛋白中鏈多肽(neurofilament medium polypeptide,NF-M)及神經(jīng)細絲蛋白重鏈多肽(neurofilament heavy polypeptide,NF-H)亞基通過 NF-L亞基構成螺旋狀三聯(lián)體,維持神經(jīng)細胞骨架的維持。另外,NFP多肽由細胞質(zhì)產(chǎn)生、通過順行性慢速軸索流向終末,參與物質(zhì)運輸[8]。由此可知,NF-L和 NF-M表達增高可通過維持神經(jīng)元細胞功能及加速軸漿運輸,起到神經(jīng)保護的功能。

3.3 二氫嘧啶酶相關蛋白 2(DRP-2) DRP-2參與腦組織的細胞骨架組成[9],是一種參與神經(jīng)分化與軸突形成的蛋白,與軸突的生長和可塑性密切相關。另有研究顯示[10],在卒中后的皮層和紋狀體的缺血半暗帶區(qū)的肥大細胞中 DRP-2 mRNA表達明顯上調(diào),參與缺血時神經(jīng)元的細胞防御機制。目前認為,缺血可激活中樞神經(jīng)系統(tǒng)的潛在的破壞性和保護性蛋白質(zhì)的合成,而 DRP-2即是一種神經(jīng)系統(tǒng)缺血時的保護性蛋白。

3.4 巢蛋白 巢蛋白(nestin)是一種新近發(fā)現(xiàn)的中間絲蛋白,屬于細胞骨架蛋白,是神經(jīng)干細胞特異性標志物[11]。這種蛋白在哺乳動物胚胎期 CNS的神經(jīng)前體細胞內(nèi)大量表達,動物出生后其表達很快降低并消失。但在少數(shù)仍保持神經(jīng)發(fā)生功能的部位(如大腦室管膜下區(qū)、嗅球、海馬齒狀回)仍有表達。有研究證明,成熟的神經(jīng)元是巢蛋白陽性細胞的基礎,在損傷后被誘導表達,其中在迷走、喉返神經(jīng)損傷后,疑核中的神經(jīng)元可能有更新的潛力[12]。腦缺血性損傷時,腦室下區(qū)和海馬齒狀回巢蛋白細胞表達增加,在缺血中心區(qū)和周邊區(qū)如紋狀體、皮質(zhì)、海馬也出現(xiàn)表達增高。目前巢蛋白已經(jīng)廣泛用于神經(jīng)干細胞的鑒定,巢蛋白的高表達預示著神經(jīng)干細胞的激活。腦缺血時,缺血區(qū)神經(jīng)元壞死或凋亡,激發(fā)非供血區(qū)已成熟神經(jīng)元重返胚胎神經(jīng)上皮細胞特征并分泌巢蛋白,作為適應缺血性腦損傷的一種代償性反應,或者缺血激活非缺血區(qū)腦實質(zhì)內(nèi)處于靜息狀態(tài)的神經(jīng)干細胞,向神經(jīng)元方向分化,遷徙到缺血區(qū)以補充神經(jīng)元的不足。

綜上所述,通過差異蛋白質(zhì)組學研究,根據(jù)各種蛋白的特性,考慮 3-NPA預處理的神經(jīng)保護機制可能涉及 ERMs蛋白家族、神經(jīng)細絲蛋白、二氫嘧啶酶相關蛋白 2等細胞骨架相關蛋白的調(diào)節(jié)表達,通過維持神經(jīng)細胞結構及促進軸突生長,加速軸漿運輸,促進神經(jīng)干細胞激活并定向分化成神經(jīng)元,最終增加腦組織對缺血-再灌注的耐受性,起到腦保護作用。

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