基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP-3)5A/6A基因多態(tài)性與多發(fā)性硬化相關(guān)性研究

李傳斌, 盧 宏, 張深義, 趙偉麗

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)是一種病因未明的中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性脫髓鞘疾病。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果提示,遺傳因素可能在 MS發(fā)病機(jī)制中起作用?；|(zhì)金屬蛋白酶在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病的炎癥反應(yīng)中有很強(qiáng)的破壞作用,通過(guò)攻擊腦血管的基底膜和破壞血-腦屏障(BBB),導(dǎo)致腦實(shí)質(zhì)的損傷,并對(duì)神經(jīng)元有不同程度的毒性作用。基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP-3)啟動(dòng)子 5A/6A基因具有多態(tài)性[1],檢測(cè)這種多態(tài)性對(duì)某些疾病的遺傳易感性及免疫調(diào)控的研究有重要意義。為了解 MMP-3啟動(dòng)子基因 5A/6A多態(tài)性與 MS相關(guān)性的關(guān)系,本研究用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)-連接酶檢測(cè)反應(yīng)(LDR)的基因分型技術(shù)檢測(cè)了 51例 MS患者及 55例正常人 MMP-3啟動(dòng)子 5A/6A基因的基因型和等位基因頻率,以探討這些基因與河南省人群中 MS遺傳易感性的可能關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床資料 研究對(duì)象均為河南地區(qū)漢族人,飲食結(jié)構(gòu)相似,各研究對(duì)象之間無(wú)血緣關(guān)系。所有研究對(duì)象均除外糖尿病、惡性腫瘤、肝腎功能不全、甲狀腺疾病、接受器官移植、嚴(yán)重營(yíng)養(yǎng)不良等疾病。全部受試對(duì)象均取得知情同意。MS組:共 51例,為 2002年 5月 ～2007年 11月間在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的或出院后定期門(mén)診隨訪的臨床確診或?qū)嶒?yàn)室支持確診的 MS患者,診斷均符合 poser標(biāo)準(zhǔn)。其中男性 19例,女性 32例,年齡14～69歲,平均 39.05±14.31歲,均經(jīng) 2名以上神經(jīng)內(nèi)科專家診斷,符合 Poser等制定的臨床確診(definite)或?qū)嶒?yàn)室支持確診的 MS診斷標(biāo)準(zhǔn)。分型情況:復(fù)發(fā)緩解型 39例,進(jìn)展復(fù)發(fā)型 1例,原發(fā)進(jìn)展型 2例,實(shí)驗(yàn)室支持確診 9例(包括視神經(jīng)脊髓炎 3例)。其中活動(dòng)期患者 33例,穩(wěn)定期患者 18例。對(duì)照組:55例,男性 29例,女性 26例,年齡 20～56歲,平均 34.31±10.71歲,均為河南漢族人,由河南省紅十字會(huì)獻(xiàn)血中心的健康獻(xiàn)血者中隨機(jī)抽取。兩組間性別、年齡差異無(wú)顯著意義。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料 PCR引物序列合成:上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司根據(jù)生物軟件 oligo6.0設(shè)計(jì);Taq酶體系(酶 5U/μl,德國(guó) Qiagen公司);dNTP(2mM/each美國(guó) RKOMEGA公司)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本基因組 DNA的提取 采用酚氯仿法,從外周靜脈全血中提取人全基因組 DNA。(1)采血:采取每例患者和正常對(duì)照組外周靜脈全血3ml加入 EDTA抗凝管中,立即放入 -20℃冰箱中冷凍保存;(2)編號(hào);(3)取 600μlEDTA抗凝全血加入1ml EP管中;(4)取紅細(xì)胞(RBC)裂解液(德國(guó) BAG公司)900μl,加入 EP管中蓋好上蓋,分別搖動(dòng) 30～40次;(5)放入離心機(jī) 6000r/min離心 45s,棄去上清;(6)再次加入紅細(xì)胞裂解液 600μl加入 1ml EP管中,蓋好蓋子,分別搖動(dòng) 30～40次;(7)放入離心機(jī) 6000r/min離心 45s,棄去上清;(8)加入白細(xì)胞(WBC)裂解液 400μl,蓋好上蓋,放在振蕩器上振蕩均勻;(9)打開(kāi)上蓋,加入冰凍無(wú)水乙醇 1000μl,蓋好上蓋,輕輕顛倒均勻,可見(jiàn)絮狀 DNA沉淀;(10)吸取絮狀 DNA加入到另一標(biāo)好相應(yīng)編號(hào)的 1ml EP管中;(11)加入 75%乙醇 1000μl蓋好上蓋搖動(dòng)幾次;(12)放入離心機(jī)中 6000r/miin離心 2min,打開(kāi)上蓋,輕輕棄去上清,打開(kāi)上蓋在吸紙上輕叩吸去殘留的乙醇;加入 400μl蒸餾水,輕輕彈動(dòng)使沉淀的 DNA充分溶解,抽樣紫外分光光度法測(cè)定 DNA濃度為0.14μg/ml;(13)放入 4℃冰箱中過(guò)夜保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 MMP-3啟動(dòng)子 5A/6A基因檢測(cè) 上游引物序列為 5'-ACATGGGTCACGGCACCT-3',下游引物序列為 5'-GTGGCCAAATATTTTCCCTGT-3';PCR體系總體積為 20μl,其中包括 DNA模板 1μl,2mmol/LdNTP 2μl,1 ×PCR緩沖液 2μl,上、下游引物各 0.2μmol/L,1u/ul TaqDNA聚合酶 0.2ul。PCR反應(yīng)條件為 95℃預(yù)變性 15min,然后于 94℃ 30s、56℃ 60s、72℃ 60s,共 35個(gè)循環(huán),再于 72℃延伸7min。PCR擴(kuò)增后用 3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是否有特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.3 連接酶檢測(cè)反應(yīng)(LDR)及測(cè)序儀電泳對(duì)人全基因組 DNA模板獲得的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行多重 LDR(Multiplex LDR),最后通過(guò)測(cè)序儀電泳讀取檢測(cè)結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)算出正常人群中 MMP-3啟動(dòng)子 5A/6A等位基因的頻率,然后進(jìn)行 Hardy-Weinber遺傳平衡定律檢驗(yàn),以 α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。對(duì)不同樣本間 MMP-3啟動(dòng)子 5A/6A基因各亞型頻率和等位基因頻率采用配對(duì)資料的 RxC列聯(lián)表進(jìn)行檢驗(yàn),以 α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 MMP-3啟動(dòng)子 5A/6A等位基因的測(cè)定標(biāo)本經(jīng) PCR/多重 LDR反應(yīng)及測(cè)序儀電泳后應(yīng)用Genemapper進(jìn)行數(shù)據(jù)分析可分出 3種基因型:MMP-3 5A/5A型(數(shù)據(jù)分析圖上于 125處出現(xiàn) 1個(gè)波峰,5A等位基因純合子);MMP-3 5A/6A型(數(shù)據(jù)分析圖上于 125、126處出現(xiàn) 2個(gè)波峰,雜合子);MMP-3 6A/6A型(數(shù)據(jù)分析圖上于 126處出現(xiàn) 1個(gè)波峰,6A等位基因純合子)(見(jiàn)圖1)。

圖1 應(yīng)用 Genemapper進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,MMP-3(5A/6A)基因的分型截圖,在 MMP-3(5A/6A)基因位點(diǎn)存在多態(tài)性:即有 5A/5A和6A/6A純合子;也存在 5A/6A雜合子

2.2 MMP-3啟動(dòng)子 5A/6A基因型頻率和遺傳平衡間的符合程度測(cè)定 進(jìn)行 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)照組和病例組 MMP-3啟動(dòng)子 5A/6A基因型頻率分布符合 Hardy-Weinberg平衡(P=0.63,P=0.26)。2.3 MMP-3啟動(dòng)子 5A/6A基因型和等位基因頻率分布比較 對(duì)照組及 MS組MMP-3(5A/6A)基因型分布(見(jiàn)表1),兩組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.12,P=0.35);對(duì)照組和 MS組MMP-3(5A/6A)等位基因頻率(見(jiàn)表2),兩組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.39,P=0.53)。

表1 對(duì)照組及 MS組 MMP-3(5A/6A)基因型比較

表2 對(duì)照組和 MS組 MMP-3(5A/6A)等位基因頻率比較

3 討 論

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘為特征的自身免疫性疾病,發(fā)病機(jī)制尚不明確。其炎性反應(yīng)過(guò)程顯示炎癥細(xì)胞是在包括黏附分子和細(xì)胞因子在內(nèi)所致的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)通過(guò)細(xì)胞聚集和滲出進(jìn)入大腦組織的[2],多發(fā)性硬化患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變的炎癥機(jī)制使人們認(rèn)識(shí)到對(duì)破壞組織的蛋白酶和調(diào)節(jié)因子應(yīng)進(jìn)行更多的研究[3]?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases MMPs)是一類 Zn2+依賴的中性蛋白酶,與分離整和素金屬蛋白酶(ADAMs)、分離整和素金屬蛋白酶血栓收縮蛋白(ADATMs)共同組成金屬蛋白酶(MPs)超家族?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)對(duì)破壞血腦屏障、炎癥反應(yīng)細(xì)胞進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)均起到重要的作用,在體外實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)能降解髓磷脂和髓鞘堿性蛋白[4]?；|(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP-3)能降解包括纖維結(jié)合蛋白、層粘連蛋白及 IV型膠原蛋白在內(nèi)的多種細(xì)胞外基質(zhì)成分,而這些成分被認(rèn)為是血腦屏障(BBB)基本結(jié)構(gòu)和功能成分[5]。MMP-3基因位于11q22,在 Ye S等[1]的研究中已經(jīng)證實(shí)人 MMP-3啟動(dòng)子區(qū)域 5A/6A基因普遍存在多態(tài)性。多態(tài)性會(huì)使 MMP-3基因的轉(zhuǎn)錄活性發(fā)生改變,從而影響體內(nèi)MMP-3水平。在 Ye S等[6]人的研究中顯示體外培養(yǎng)的細(xì)胞中含 MMP-35A等位基因有著更強(qiáng)的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性。在 Medley等[7]人的研究中發(fā)現(xiàn)在大動(dòng)脈血管疾病中 MMP-35A/5A基因型的患者在血管壁中 MMP-3的表達(dá)和 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平與雜合子基因型(5A/6A)相比是增高的,而基因型為 6A/6A的 MMP-3的表達(dá)和 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平與之比較則是降低的。Maeda等[8]的研究中發(fā)現(xiàn)在多發(fā)性硬化患者的病灶中 MMP-3的表達(dá)水平增高,在 Kouwenhoven等[9]的研究中應(yīng)用原位雜交技術(shù)檢測(cè)多發(fā)性硬化患者外周血單核細(xì)胞發(fā)現(xiàn) MMP-3的 mRNA轉(zhuǎn)錄水平增高。在 Kanesaka等[10]的研究中發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)-緩解型多發(fā)性硬化患者中,血清 MMP-3水平顯示有連續(xù)性的變化,在復(fù)發(fā)期較緩解期有明顯的增高,且多在 1m內(nèi)恢復(fù)至緩解期的水平。而且在 Tamara等[11]人的研究中發(fā)現(xiàn) MMP-3(5A/6A)基因多態(tài)性與多發(fā)性硬化疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。這些研究提示 MMP-3在多發(fā)性硬化疾病中起著重要的作用,降低 MMP-3水平或調(diào)節(jié) MMP-3基因轉(zhuǎn)錄活性也許會(huì)對(duì)緩解多發(fā)性硬化患者的病情起到有益的作用。

在我們的研究中未發(fā)現(xiàn) MS患者 MMP-3(5A/6A)基因各基因型和等位基因頻率與正常對(duì)照組有顯著性差異(P均大于 0.05),提示 MMP-3(5A/6A)基因多態(tài)性與 MS的易感性不相關(guān)。這與 Tamara等[11]人所研究的結(jié)果類似。但在進(jìn)行更深一步的研究之前,我們?nèi)圆荒芎雎?MMP-3(5A/6A)基因遺傳多態(tài)性與多發(fā)性硬化易感性之間的聯(lián)系。在我們看來(lái) MMP-3(5A/6A)基因的遺傳多態(tài)性可能與多發(fā)性硬化的發(fā)病無(wú)關(guān),其原因可能是 MS是一種多基因遺傳病,MS的遺傳易感性可能是由多種基因決定的,其發(fā)病依賴于多個(gè)基因獨(dú)立的或累積的效應(yīng);不同人群的患者其易感基因也可能是不同的。環(huán)境因素在 MS的發(fā)病中也有著不可忽略的作用。另外,本研究所涉及的病例較少以及病例-對(duì)照研究產(chǎn)生的偏移也會(huì)影響研究結(jié)果。

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