創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙大鼠海馬組織 5-HT1受體 mRNA的表達

王 芳

PTSD是指受到異乎尋常的威脅或受到巨大災(zāi)難所致的心理創(chuàng)傷,導(dǎo)致出現(xiàn)長期持續(xù)性精神障礙[1,2],近年來成為研究和關(guān)注的焦點。5-HT受體(5-HT receptor)與焦慮、雙相情感精神障礙、沖動行為、酒精依賴、精神分裂癥等有關(guān)[3]。在 PTSD大鼠5-HT受體研究結(jié)果不一[4,5]。本實驗通過復(fù)制PTSD模型,提取大鼠海馬總 RNA,應(yīng)用 RT-PCR方法檢測 5-HT受體各亞型的表達,探討 5-HT系統(tǒng)在PTSD發(fā)病中的作用。

1 對象和方法

1.1 動物模型的建立 150～180g的成年雄性Wistar大鼠 35只(中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供),適應(yīng)性喂養(yǎng) 7d后,將動物隨機分為對照組(10只)和模型組(25只)。模型組按照 SPS(Single-Prolonged Stress)方法復(fù)制 PTSD模型[6],將大鼠連續(xù)進行以下步驟處理:禁錮 2h;強迫性游水 20min(水深40cm,水溫 25℃);休息 15min后乙醚麻醉至意識喪失。各組動物無干擾飼養(yǎng),常規(guī)攝食飲水,飼養(yǎng)溫度為 18～22℃。

1.2 實驗方法

1.2.1 水迷宮(Morris water mace,MWM)實驗

取對照組和模型組大鼠各 5只,分別進行定位航行實驗,用于測量大鼠在水迷宮中學(xué)習(xí)記憶的能力,記錄各組大鼠逃避潛伏期(EL)。

1.2.2 血清皮質(zhì)醇濃度監(jiān)測 水迷宮實驗完成后,經(jīng)大鼠心臟采血 3-5ml,3000g離心 10min,收集血清。用化學(xué)發(fā)光法檢測血清皮質(zhì)醇濃度。

1.2.3 海馬總RNA提取和 RT-PCR 將其余5只對照組大鼠和 20只模型大鼠(SPS后 1d、4d、7d、14d)麻醉后斷頭取腦,在冰上快速分離海馬組織,按照每 100mg加入 1mlTRIZOL試劑,充分碾磨,靜止5min。加入 1/5氯仿,混勻,室溫靜止 3min,4℃、12000g離心 15min。將水相轉(zhuǎn)入新的 EP管中,加入等體積異丙醇,混勻,室溫靜止 10min,4℃、12000g離心 10min。棄上清,加入用 DEPC水新鮮配制的預(yù)冷 75%乙醇,振蕩洗滌 RNA,4℃、7500g離心10min。棄上清,干燥 5-10min。用無 RNase水溶解RNA,用分光光度計定量后-80℃保存。取 1μgRNA,按照 Takara公司 RNA PCR Kit(AM)Ver.3.0試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄和 PCR擴增。各引物序列見表1。5-HT1A PCR擴增條件:94℃ 4min;94℃ 30s;55℃ 30s;72℃ 25s;35個循環(huán),72℃ 8min。擴增結(jié)束后取 5μl擴增產(chǎn)物進行 1%瓊脂糖凝膠電泳,利用天能 GIS凝膠成像系統(tǒng)進行觀察拍照并進行積分光密度分析,以目的條帶與內(nèi)參照 β-actin的平均吸光度的比值表示相對表達水平,進行半定量分析。

表 15-HT受體 1各亞型和β-actin PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用 SPSS統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)均以±s表示,進行方差分析和 t檢驗,P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MWM實驗結(jié)果 結(jié)果顯示,對照組與模型組大鼠平均逃避潛伏期分別為 5.632s±1.065s、20.762s±3.236s,兩組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.932,P＜0.01)。

2.2 皮質(zhì)醇濃度 對照組與模型組大鼠 16點血清皮質(zhì)醇濃度分別為 1.25μg/dl±0.12μg/dl和0.58μg/dl±0.09μg/dl,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (t=7.340,P＜0.01)。

2.3 海馬 5-HT1A受體 mRNA表達 經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析,對照組大鼠海馬 5-HT1AmRNA表達的積分光密度為 1.223±0.152,SPS1d、4d、7d和 14d分別為 0.846±0.067、0.510±0.052、1.007±0.137、1.109±0.106。見圖1和圖2。2.4 海馬 5-HT1其他受體亞型的表達 PCR結(jié)果沒見其他亞型表達。

圖1 海馬 5-HT1AmRNA表達的分析結(jié)果

圖2 海馬 5-HT1A RT-PCR電泳圖

3 討 論

PTSD是指由于異常威脅性或災(zāi)難性心理創(chuàng)傷導(dǎo)致延遲出現(xiàn)和長期持續(xù)的精神障礙。其臨床表現(xiàn)以再度體驗創(chuàng)傷為特征,并伴有情緒的易激惹和回避行為,是一種創(chuàng)傷后心理失衡狀態(tài)[7]。但 PTSD不同于一般的應(yīng)激反應(yīng)及其它精神疾病,PTSD患者血液中的皮質(zhì)酮基礎(chǔ)水平往往較低,存在下丘腦-垂體-腎上腺素軸(HPA軸)的紊亂[8]。以往由于缺乏理想的動物模型,使 PTSD的基礎(chǔ)研究受到了很大限制。SPS模型作為 PTSD動物模型的確認(rèn),為深入研究應(yīng)激障礙的發(fā)病機制提供了行之有效的方法[9]。本實驗采用 SPS復(fù)制 PTSD模型,水迷宮實驗結(jié)果表明模型組大鼠逃避潛伏期明顯長于對照組大鼠,提示 SPS后大鼠記憶力減退。血清皮質(zhì)醇濃度也明顯低于對照組。這些都符合 PTSD的臨床表現(xiàn),說明模型復(fù)制成功。

海馬是參與調(diào)節(jié)情感、認(rèn)知、行為的重要邊緣系統(tǒng)結(jié)構(gòu),富含突觸后膜 5-HT1A受體[10]。海馬 5-HT系統(tǒng)特別是 5-HT受體的功能改變在精神疾病發(fā)病機制和治療中具有重要作用。5-HT1A受體和情感障礙關(guān)系最為密切[10]。研究發(fā)現(xiàn)在抑郁癥患者海馬 5-HT1A受體的結(jié)合下降,5-HT1A受體 mRNA減少[11,12]。海馬是大腦的重要結(jié)構(gòu),在學(xué)習(xí)和記憶功能以及調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌和自主神經(jīng)活動中起著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn) PTSD患者右側(cè)海馬體積縮小[13]。5-HT1A受體還與神經(jīng)發(fā)生有關(guān),系統(tǒng)應(yīng)用5-HT1A受體激動劑可引發(fā)成年大鼠齒狀核錐體細胞神經(jīng)發(fā)生效應(yīng)。海馬萎縮的一個原因可能是由于海馬區(qū) 5-HT1A受體功能紊亂導(dǎo)致成年大鼠齒狀回錐體細胞分化的顯著減少,使海馬萎縮。本實驗結(jié)果表明,在大鼠海馬 5-HT1受體中,只有 5-HT1A亞型有表達。SPS刺激后大鼠海馬 5-HT1A受體 mRNA表達降低,SPS刺激后 4d達到最低,以后逐漸上升,到刺激后 14d,5-HT1A受體 mRNA的表達和對照組沒有顯著性差異。在 PTSD發(fā)病過程中,應(yīng)激有可能通過影響 5-HT1A受體 mRNA的表達從而影響海馬功能,導(dǎo)致一系列精神障礙。在 PTSD疾病治療和藥物開發(fā)中,也可以通過影響 5-HT1A受體作為切入點。

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